- 介紹： 基 因 型F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galE15 galK λ-rpsL nupG Hte(TetR)簡(jiǎn) 要 說(shuō) 明 DH10B-Plus電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。DH10B-Plus菌株來(lái)源于DH10B菌株，在DH10B菌株中引入Hte突變，提高了細(xì)胞膜的通透性和對(duì)瞬時(shí)高壓的耐受進(jìn)而提高了電擊轉(zhuǎn)化效率。DH10B- Plus菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (無(wú)論真核生物還是原核生物的基因組DNA都能被高效的轉(zhuǎn)入DH10B- Plus中)。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取，ϕ80dlacZ ΔM15標(biāo)記的存在使DH10B-Plus可用于藍(lán)白斑篩選。DH10B-Plus電擊感受態(tài)細(xì)胞具有鏈霉素和四環(huán)素抗性，適用于大質(zhì)粒的構(gòu)建或各種文庫(kù)構(gòu)建，經(jīng)特殊工藝處理，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>2×1010 cfu/μg DNA。 操 作 說(shuō) 明1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。2. 取-80℃保存的DH10B-Plus電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物)并用手撥打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。
- A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19；
- B. 對(duì)于連接產(chǎn)物，大部分公司的T4連接酶反應(yīng)體系或50度反應(yīng)重組體系可與DH10B-Plus電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化，無(wú)需進(jìn)行DNA純化，但DNA濃度不能過(guò)高，DNA濃度不超過(guò)100 ng/μl，體積不超過(guò)5 μl/50 μl感受態(tài)。
- C. 對(duì)鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，然后與DH10B-Plus電擊感受態(tài)混合進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。
- 3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。
- 4. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。
- 5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補(bǔ)加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘。
- 6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請(qǐng)選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè)）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)13-17小時(shí)。S.O.C 培養(yǎng)基配方2% Tryptone0.5% Yeast Extract10 mM NaCl2.5 mM KCl10 mM MgCl210 mM MgSO420 mM glucosePH-7.0S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtainmaximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).
- 注 意 事 項(xiàng)
- 1. 加入DNA時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10，電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。
- 2. DH10B-Plus菌株有鏈霉素和四環(huán)素抗性，不可用于具有鏈霉素或四環(huán)素抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。
- 3. 當(dāng)DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
- 4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。
- 5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)�；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。
- 6. 對(duì)于連接產(chǎn)物或文庫(kù)轉(zhuǎn)化，DNA濃度及鹽離子濃度不可過(guò)高，保證DNA濃度不超過(guò)100 ng/μl。過(guò)高濃度連接產(chǎn)物或文庫(kù)DNA會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，鹽離子濃度過(guò)高會(huì)增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。
- 7. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)避免用力過(guò)猛，以免剪切力過(guò)大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。8. 電擊感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。
- 儲(chǔ)存條件： -80℃
- 用途： 克隆感受態(tài)細(xì)胞
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