病毒RNA抽提試劑盒(離心柱式)
產品簡介：
離心柱式病毒RNA抽提試劑盒( Viral RNA Isolation Kit with Spin Column)是一種基于離心柱 法從含病毒的血漿、血清、體液、拭子及細胞及其培養上清、組織等樣品中安全、快速、便捷、穩定、高效、高質量地抽提長度 大于200個核苷酸(nucleotide, nt)的病毒RNA的試劑盒。抽提獲得的大于200個核苷酸的病毒RNA樣品(可能同時含有樣品中的其 它RNA)可以用于各種常規用途。
本試劑盒抽提得到的病毒RNA可用于qRT-PCR、反轉錄、RT-PCR、qPCR、Northern、點雜交(Dot Blot)、純化mRNA、體外 翻譯、RNase protection assay、cDNA克隆等下游實驗；也可用于基因表達芯片分析(microarray)、高通量測序(high throughput sequencing)等對RNA質量要求較高的情況。
本試劑盒抽提病毒RNA的基本流程如圖1所示。樣品在裂解液中迅速裂解，釋放出總RNA，然后讓RNA特異性地結合到純化柱上， 而蛋白質等其它組分通過高速離心被有效去除，再通過3次洗滌充分去除非特異性結合的蛋白、鹽等雜質，最后用洗脫液將高純度 的RNA洗脫下來。
本試劑盒使用安全。本試劑盒通過特殊的柱純化介質進行病毒RNA分離純化， 能有效避免傳統的Trizol法抽提時使用的酚、氯仿 等有毒有害有機試劑。
本試劑盒使用快速、便捷。本試劑盒采用柱純化，無需繁瑣的病毒RNA沉淀步驟，抽提操作過程僅15-20分鐘。相比于傳統的Trizol 抽提法，本試劑盒的操作流程顯著簡化， 縮短了抽提時間， 降低了病毒RNA被降解的風險。和國外同類柱純化產品相比，所需操 作步驟和操作時間基本一致。
本試劑盒適用于含病毒的血漿、血清、體液、拭子及細胞及其培養上清、組織等樣品中病毒RNA的抽提，為提高病毒RNA的提取 量，建議自備carrier RNA。Carrier RNA一方面可以提高微量病毒RNA在純化過程中與純化柱的結合效率和洗脫效率；另一方面 可以降低被可能存在的痕量殘留RNase降解的風險。Carrier RNA在病毒含量較少的情況下效果更為明顯。Carrier RNA推薦購 買我司的R0036 Carrier RNA (病毒RNA等抽提用)
本試劑盒小包裝R0035S可用于12個樣品的RNA抽提，中包裝YS0035S可用于50個樣品的RNA抽提，大包裝R0035L可用于200個 樣品的RNA抽提。
包裝清單：
| 產品編號 | 產品名稱 | 包裝 |
| YS0035S-1 | 裂解液 | 32ml |
| YS0035S-2 | 結合液 | 32ml |
| YS0035S-3 | 洗滌液I | 32ml |
| YS0035S-4 | 洗滌液II | 63ml |
| YS0035S-5 | 洗脫液 | 5ml |
| YS0035S-6 | RNA純化柱及廢液收集管 | 50套 |
| YS0035S-7 | RNA洗脫管 | 50個 |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：室溫保存， 一年有效
注意事項：
如果樣品中含有細胞或組織，不影響病毒RNA的抽提，但須注意抽提獲得的病毒RNA中包含細胞或組織的RNA。
為提高病毒RNA的提取量，推薦使用我司的Carrier RNA (病毒RNA等抽提用) (R0036)或自備carrier RNA。
本試劑盒提供的所有試劑和耗材都是RNase-free，操作時應小心，避免被污染。所有自行準備的試劑和耗材也都應是RNase-free。 如果可能有RNase污染，可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后高溫高壓滅菌并烘干。操作時應避免對著樣品或所使用的試劑 盒耗材呼氣或說話，以防RNase污染。建議戴一次性口罩操作。
對于操作環境中RNA酶的去除，推薦使用我司生產的RNase and DNase Away (R0123)以去除實驗桌面上或其它接觸面上的 RNase。
使用凍存的樣品抽提RNA的效果通常比新鮮的樣品差一些。因為在樣品凍融過程中一些RNase會被釋放出來并消化樣品中的 RNA，建議盡量避免凍融。對于病毒樣品， 推薦使用我司生產的RNALater™病毒RNA穩定保存液(R0141)進行保存以保證樣品 RNA的完整性。
本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
結合液、洗滌液中含有乙醇，使用后須旋緊瓶蓋以防揮發，并須按照易燃試劑的相關規范進行存放和使用。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 使用說明：
1. 樣品的準備。
a. 液體樣品的準備。
含病毒的血漿、血清、無細胞體液、拭子、細胞培養上清等樣品，按照常規方法取樣。每100µl液體樣品加入300µl裂解液。輕 輕顛倒混勻3-5次。
選做：為提高病毒RNA的提取量，建議在不含或含很少細胞或者組織的樣品中加入carrier RNA。推薦使用我司的R0036 Carrier RNA (病毒RNA等抽提用)，或使用下面方法提取：取任意新鮮的細胞或組織，用抽提試劑盒(推薦R0024/R0026/R0027 動物RNA抽提試劑盒(離心柱式))或Trizol法提取RNA (R0011、R0016)，作為carrier RNA。每個病毒樣品需要 2-5µg carrier RNA， 直接添加至裂解液中即可。
b. 細胞樣品的準備。
收集50-100萬左右帶有病毒的細胞。對于懸浮細胞， 1000-2000×g離心1分鐘后棄上清，加入300μl裂解液，輕輕吹打8-10次至 固懸物溶解、溶液澄清；對于貼壁細胞， 吸凈培養液后加入300μl裂解液，輕輕吹打5-10次至固懸物溶解、溶液澄清， 轉移至 一潔凈離心管內。
c. 組織樣品的準備。
取15-20mg帶有病毒的動物組織，置于液氮中研磨成粉末，立即加入600μl裂解液。也可將組織置于1.5ml離心管中，迅速加入 600μl冰浴預冷的裂解液，用微型電動勻漿器勻漿，或者用普通玻璃勻漿器進行勻漿。研磨或勻漿后， 輕輕吹打勻漿液8-10次， 室溫放置3-5分鐘。然后約14,000×g離心2分鐘，將上清液移至新的離心管中。對于比較容易裂解且勻漿很充分的組織(如肝組 織、腦組織等)可以不用高速離心而直接進入步驟2。
注意：細胞的數量一般不超過500萬，不超過100萬細胞宜使用300μl裂解液，多于100萬細胞宜使用600μl裂解液。動物組織的用 量一般不超過30mg，用量過多可能會因裂解不充分導致得率下降。組織樣品在裂解和離心后， 離心管下部可能會有一些膠狀物質， 宜作為上清轉移至下一步操作。如果棄除膠狀物， 會導致得率下降約30-50%。后續加入結合液后膠狀物會消失。離心是為了去除 未勻漿充分的明顯塊狀物。如果裂解后仍有粘稠物，需增加吹打次數至溶液完全澄清。對于富含RNase的樣品， 裂解液中宜添加 DTT至終濃度為40mM或添加β-巰基乙醇至終濃度為1%。
2. 加入等體積(指病毒樣品和裂解液的總體積)結合液至裂解液中，輕輕顛倒混勻3-5次。此時可能會有沉淀物產生，屬于正常現象。
3. 將混合物(包括沉淀物)轉移至純化柱內， 12,000×g離心30秒，倒棄收集管內液體。
注意：當裂解液的體積大于300µl時， 在加入等體積結合液后，總體積會超過純化柱的容量，這時應分成2次過柱，即將一半的混 合物過柱后，再將剩余的混合物重復步驟3一次。對于一些特殊的樣品，如出現溶液未完全通過時， 可延長離心時間至1-2分鐘， 或者加大離心力至16,000×g。對于一些能快速啟動達到12,000×g的離心機，離心30秒已經足夠，對于一些啟動速度緩慢的離心 機本步驟及后續步驟中的30秒離心宜調整為60秒。
4. 加入600µl洗滌液I， 12,000×g離心30秒，倒棄收集管內液體。
5. 加入600µl洗滌液II， 12,000×g離心30秒，倒棄收集管內液體。
6. 重復步驟5一次。
7. 最高速(約14,000-16,000×g)離心2分鐘，去除殘留的液體。
8. 將RNA純化柱置于本試劑盒提供的RNA洗脫管中，加入30-50µl洗脫液，室溫放置2-3分鐘，最高速離心30秒，所得溶液即為純
化的病毒RNA樣品。樣品病毒RNA提取量可能會較少， 用紫外分光光度計較難測出，建議用qRT-PCR法檢測(推薦使用我司生產的D7277 BeyoFast™ Probe One-Step qPCR Mix或者D7268 BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit)。不同數量的 新冠病毒N基因慢病毒保存在含咽拭子的病毒樣品常規保存液(R0143)中，用本試劑盒提取病毒后使用新型冠狀病毒(2019-nCoV) 雙熒光qRT-PCR試劑盒進行檢測，此處的病毒量為每個PCR反應體系中病毒的IU數。
| Amount ofvirus (IU/Reaction) | 400 | 40 | 4 | |
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Ct Value | Replicate 1 | 24.58 | 27.93 | 32.19 |
| Replicate 2 | 25.07 | 28.27 | 31.58 | |
| Replicate 3 | 25.21 | 28.05 | 31.73 | |
| Average | 24.95 | 28.09 | 31.84 | |
注意：洗脫液需要加到純化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需獲得更高濃度的樣品，可把洗脫液的體積減小至20µl，但洗脫下 來的RNA量會相對減少。室溫較低時，洗脫液在37ºC預熱片刻對得率有所幫助。此外，洗脫后的溶液再次加回到原純化柱再離心 洗脫一次，可提高得率約10-30%；或者在第一次洗脫后使用新的洗脫液再洗脫一次，會獲得約為第一次洗脫量15-40%的RNA。
