| 產(chǎn)品及特點(diǎn) | 人類免疫缺陷病毒１型（HIV-１）患者血漿中病毒 RNA 水平一直以來是評(píng)判抗病毒治療效果或預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)。但是，經(jīng)抗病毒治療后血漿 HIV-１RNA 已達(dá)到基線水平感染者的血液、精液或淋巴結(jié)中仍可以檢測(cè)到 HIV-１原病毒 DNA 的存在，構(gòu)成病毒儲(chǔ)藏庫，對(duì)清除 HIV-１病毒構(gòu)成嚴(yán)重阻礙。所以在病毒載量已經(jīng)檢測(cè)不到的情況下，HIV-１原病毒 DNA 水平可以作為除 CD4+Ｔ細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量之外的另一標(biāo)志物。本公司開發(fā) HIV-1 前病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點(diǎn)： 1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。 2. 引物根據(jù) HIV-1 前病毒專一區(qū)設(shè)計(jì)，特異性高。 3. 熒光定量PCR 檢測(cè)，比常規(guī) PCR 更加靈敏。 4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。 5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。 6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 | ||||
| 規(guī)格及成分 |
| 成分 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
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| 2×qPCR Magic Mix | 90408 | 500 μL（棕色管） | |||
| 熒光PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） | |||
| HIV-1 前病毒染料法 qPCR 引 物混合液 | 14-22700yw | 100 μL（白蓋） | |||
| HIV-1 前病毒染料法 qPCR 陽 性對(duì)照(1×10E8 拷貝/μL) | 60908-22700pc | 50 μL（黃蓋） | |||
| 使用手冊(cè) | 14-22700sc | 1 份 | |||
| 運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。 | ||||
| 自備試劑 | DNA 模板、超純水、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。 | ||||
| 使用方法 | 一、稀釋 PCR 陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例） 1.注意：由于陽性對(duì)照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。 2.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。 3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。 4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。 5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。 6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分 | ||||
震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
8. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照），
一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL PCR 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加上一定量的水作為制備的陽性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。制備所得成為樣品 DNA。
9. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)陽性對(duì)照稀釋液，濃度為 10E4 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)，其余不變。
11.
在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置注:僅ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
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| 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。 12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。 四、數(shù)據(jù)處理 13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。 14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 36。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 35 則為陰性，如果小于或等于 30 則為陽性。如果在 30-35 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 35，擴(kuò)增曲線有 明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。 |
| 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | HIV-1 前病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒 |
