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貓泛白細胞減少癥染料法熒光定量 PCR 試劑盒

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 貓泛白細胞減少癥染料法熒光定量 PCR 試劑盒Feline Parvovirus,FPV)會引起貓科動物之間的傳染病,以高熱、嘔吐、白細胞嚴重減少和腸炎為特征,感染病毒后,病貓會迅速脫水,消瘦,眼窩深陷,被毛凌亂,皮膚無彈性,耳鼻,四肢發涼,精神高度沉郁,休克,死亡。從病初癥狀輕微到嚴重一般不超過 2 天,整個病程一般不超過一周, 發病迅速,傳播范圍廣,對貓科動物健康造成嚴重損害,因此快速檢測貓泛白細胞減少癥具有重要意義。為此本公司開發了簡單快捷的貓泛白細胞減少癥通用染料法熒光定量 PCR 檢測試劑盒,它具有下列特點:

1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。

 

2. 根據貓泛白細胞減少癥保守序列設計的專一性引物,與相關病毒無交叉反應。

 

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。

 

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測,避免后續污染。

 

5. 本試劑盒足夠 50  20μL 反應體系的熒光定量 PCR。

 

本產品只適用于科研,不能用于臨床診斷

 

成分

編號

十孔盒包裝

2×qPCR MagicMix

90408

500μL(棕色管)

熒光 PCR 專用模板稀釋液

180701

1 mL(黃蓋)

貓泛白細胞減少癥 PCR 引物混合物

14-21400yw

100μL(白蓋

貓泛白細胞減少癥 PCR 陽性對照

 

(1×10E8  拷貝/μL)

 

14-21400pc

 

50μL(紅蓋

DNA 病毒裂解液(試用裝)

3674a

15 次(9 mL)

使用手冊

14-21400sc

1 份

 

低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。

DNA 模板、10×ROX(根據機型決定,具體見使用方法)

一、稀釋 PCR 陽性對照 10E2-10E7 拷貝/μL  6  10 倍稀釋度為例

 

1.注意:由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原, 本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。

2.標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。

 

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液最好用帶芯槍頭,下同

 

4.   7  號管中加入  5  μL  1×10E8  拷貝/μL  的陽性對照,充分震蕩  1  分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭,在 6 號管中加入 5  μL  1×10E7 拷貝/μL  的陽性對照(上步稀釋所得)充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭,在 5 號管中加入 5  μL  1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

 

二、樣品 DNA 的制備

 

8. 如果有 N 個樣品,必須設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照), 一個是 NC(樣品制備陰性對照。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4(濃度為 1×10E4  拷貝/μL10μL 相當于 1 萬拷貝或第 5 (濃度為 1×10E5拷貝/μL10μL  相當于  10  萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品,則PC  NC 的體積也必須是 200μL。

9. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費贈送 15 次一管式病毒 DNAout ,其使用手冊可從本公司網站



 通過搜索產品名稱一管式病毒DNAout 下載。

 

三、設置 qPCR 反應(20 μL 體系,在樣品制備室進行)

 

10. 如果只做 1 次重復,則標記 N+9  PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 樣品,1 個用于 PCR 陰性對照,6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復,則反應設置數量相應增加 2  3 倍。
在標記管中按下表加入各成分本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

成分

樣品管

 

N+2 個

PCR 陰性

 

對照管

PCR 陽性

 

對照管(2-7 管)

2×qPCR MagicMix

 

(棕色管)

 

10 μL

 

10 μL

 

10 μL

貓泛白細胞減少癥 PCR

 

引物混合液(白蓋)

 

2 μL

 

2 μL

 

2 μL

自備 10×ROX (見注)

2 μL

2 μL

2 μL

N+2 待測樣品 DNA 模板

6 μL

不加

不加

 

7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液(2-7 號

 

 

不加

 

 

不加

 6μL2 號樣到

2 號管,3 號樣到 3號管…)

 

  iCycler IQMJ OptionMJ Chromo4MX3000MX4000RotorGene 3000、RotorGene 6000  LightCycler480)不需要使用 ROX,則用水替代。

3. 蓋上蓋子后上機,按下面參數進行 PCR(具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行優化)。

 

預變性

94℃

5 分鐘

 

PCR 反應

 

(30 個循環)

94℃

60 秒

 

50℃

60 秒

 

72℃

60 秒

 

13. 數據采集

 

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時, 最大吸收光譜在 471 nm,結合 DNA 時的最大吸收光譜在 500 nm,最大發射光譜在 530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。

四、數據處理

 

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值,再推算出其濃度。

15. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等  40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct  值應該小于或等于30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 

為陰性,如果小于 40,則為陽性

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