pUCm-T 載體 & PCR 產物克隆試劑盒
產品編號： B620433_B620435
包裝規格： B620433, 20 次/100 次； B620435, 20 次/100 次
試劑盒組成
組分
B620433
20 次
B620433
100 次
B620435
20 次
B620435
100 次
pUCm-T vector 1 µg 5 µg 1 µg 5 µg
10¥Ligation Buffer 50 µl 200 µl
50% PEG4000 50 µl 200 µl
T4 DNA Ligase, 5U/µl 100 U 500 U
Sterilized ddH2O 1 ml 1 ml
產品介紹
T-載體 PCR 產物克隆試劑盒適用于克隆帶有 3’ 末端 A 突出的的 PCR 產物。本試劑盒提供的獨特連接系統允許用戶在
1~2 小時內的時間里完成連接反應。
本公司的 pUCm-T 載體是為簡化 PCR 產物的克隆而設計的。許多熱穩定的 DNA 聚合酶，如 Taq DNA 聚合酶、Tth DNA
聚合酶等擴增的 PCR 產物在 3’末端后都帶有一個突出的堿基 A，這樣的 PCR 產物很容易連接到帶有突出堿基 T的 T載體上。
Sangon 生產的 pUCm-T 是一種新穎的 pUC 系列 T 載體，其多克隆位點大多是單切點，以及 β-半乳糖苷酶讀碼框的調
整，大大方便了克隆的藍/白篩選。插入位點兩端獨特設計的兩個 PstI 位點使插入片段可以用 Pst I 單酶切進行檢測，也可以
用非常廉價而高效的 EcoR I 和 Hind III 雙酶切進行檢測。可以用 M13 通用引物和 T7 啟動子引物對 PCR 產物進行測序。
pUCm-T 含有 T7 RNA 聚合酶的啟動子，可以對插入片段進行體外轉錄。
本文末列出了 pUCm-T 相關的技術資料，其全序列可參照 pUC19（GenBank Accession Number M77789），只是其多
克隆位點部分的序列有所不同。
連接反應的準備
PCR 產物是否需要純化取決于擴增產物的質量。如果 PCR 產物特異性很高，則不需要對產物進行純化。但是如果將質
粒作為模板，則需要對 PCR 產物進行純化，因為質粒模板在轉化后會形成白色的菌落。PCR 產物可通過瓊脂糖凝膠電泳進
行分離。本公司的 PCR 產物膠回收試劑盒(B610353) 可有效回收>60 bp 的 DNA 片段。
Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA 聚合酶擴增的 PCR 產物會在 3’末端添加堿基 A。Taq DNA 聚合酶同具有 3’Æ5’ 外
切酶活性的 Pfu、Pwo、Tli 或 Deep vent DNA 聚合酶共同擴增的產物也可能會在 3’末端添加堿基 A。PCR 產物 3’端含有突
出的堿基 A 可以被連接到 pUCm-T 上。具有 3’Æ5’ 外切酶活性的 DNA 聚合酶擴增的 PCR 產物為平末端，克隆這樣的片段
需要在平末端加 A。
本公司的 A-Tailing Kit（B620513）可有效地在 3’末端添加堿基 A。
連接反應
1. 在一個標準的10 µl連接反應體系中，加入50ng (1 µl) pUCm-T vector、0.2 pmol PCR產物、1 µl 10¥ligation Buffer 和1
µl T4 DNA Ligase, 并加入ddH2O至終體積為10 µl，通常不需要對PCR產物進行定量。連接反應體系可根據如下進行配
制：
1 µl 10¥Ligation Buffer
1 µl 50%PEG
Sangon Biotech
1 µl pUCm-T vector
X µl 純化的 PCR 產物
Y µl Sterilized water
1 µl T4 DNA Ligase
10 µl (Final Volume)
注意： T4 DNA Ligase 最后加。
2. 16~23°C連接1 h~過夜。
注意：常規實驗 1 h 已足夠。
轉化
推薦使用本公司的 Competent Cell Preparation Kit (B620523 或 B620525)
1. 將100 µl 感受態細胞冰上解凍，完全溶解后輕輕混勻 。
2. 加入5 µl上述連接液，輕輕混勻，冰上放置30 min。
3. 42°C 水浴熱激1.5 min。再在冰上放置 2~10 min。
4. 加入400 µl LB 培養基，37°C 200~250 rpm振蕩培養1 h。
5. 4000 rpm離心5min，用槍頭吸掉400 µl上清液，用剩余的培養基將細胞重懸。
6. 將細菌懸液均勻涂布在含有20 μl IPTG（100 mM）和100 μl X-gal（20 mg/ml）的氨芐青霉素抗性的LB平板上。
注意：使用細菌的數量取決于連接和轉化的效率。
7. 將平板在37°C正向放置 1 小時后吸掉過多的液體， 倒置培養過夜。
篩選
通過藍/白斑篩選轉化子
當外來 DNA 片段被克隆進 pUCm-T時，LacZ 基因讀碼框的編碼序列被插入的外來 DNA 改變，因此a-序列的活性被影響，，
重組克隆可在 X-gal/IPTG 平板上通過顏色進行篩選，未發生重組克隆的菌落為藍色。用牙簽挑選 IPTG/X-gal 平板上的白色
菌落，轉移到含 Amp+的液體培養基 37°C 過夜培養。
轉化子的鑒定
1. 從含白色菌落的液體培養基中提取質粒，用PstI 或其它合適的限制性內切酶酶切質粒，檢測插入片段的大小，以證明該
菌落是否含有目的片段。
2. 克隆的目的片段可使用M13通用引物或其它合適的引物進行測序，進一步證明該菌落含有目的片段。
附錄
1. A. pUCm-T載體圖譜 Sangon Biotech
2. UCm-T載體啟動子和多克隆位點序列
M13/pUC Sequencing Primer(-20) EcoR I Sac I Kpn I T7 Transcription Start Nde I
T7 Promoter
5’-G TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA ATT CGA GCT CGG TAC CGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG ACA TAT
GAT
3’-C AAC ATT TTG CTG CCG GTC ACT TAA GCT CGA GCC ATG GCA TTA TGC TGA GTG ATA TCC CGC TGT ATA CTA
A
PCR Products
Cla I EcoR V Nco I Not I Pst I A Bgl II BamH I Xho I
CGA TGA TAT CCC ATG GGC GGC CGC CTG CAG ACC AGG TCT AGA CTG GAG ATC TGG ATC CCT CGA
GTC
GCT ACT ATA GGG TAC CCG CCG GCG GAC GTC TGG TCC AG T TCT GAC CTC TAG ACC TAG GGA GCT CAG
Xba I Sal I Pst I Pae I Hind III
TAG AGT CGA CCT GCA GGC ATG CAA GCT TGG CGT AAT CAT GGT CAT AGC TGT TTC CTG -3’
ATC TCA GCT GGA CGT CCG TAC GTT CGA ACC GCA TTA GTA CCA GTA TCG ACA AAG GAC -5’
Lac Z
M13/pUC Reverse Primer (-26)
Sangon Biotech
3. pUCm-T載體的酶切位點
a. 不切割 pUCm-T 載體的限制性內切酶
AcaI,AccIII,AceII,Afa24RI,AgeI,AmaI,AosIII,ApaI,ApeI,AscI,Asp78I,AtuCI,AvaIII,AvrII,BaeI,BalI,Bbf7411I,BbsI,BclI,Bco102I
I,BfrBI,BlpI,BmgI,BplI,Bpu10I,Bpu1268I,BsaAI,BsaFI,BsaKI,BsaMI,BscEI,BscJI,Bse59I,BseRI,BsgI,BsiWI,BsmFI,BsmGI,B
sp120I,Bsp87I,BspGI,BspLU11III,BsrGI,BssHII,Bst1107I,Bst29I,Bst98I,BstEII,BstXI,Bsu36I,CfrAI,CspI,Csp45I,DraIII,DrdII,
EciAI,EciEI,Eco47III,Eco72I,EcoAI,EcoBI,EcoDI,EcoDXXI,EcoDR3,EcoEI,EcoNI,EcoR124I,EcoR124II,EcoRD3,FinI,FseI,
HpaI,MluI,Mlu1106I,Mlu113I,Msp20I,MunI,NaeI,NgoMI,NheI,NruI,NsiI,PacI,PauI,PfuI,PmeI,Ppu10I,Ppu6I,PpuMI,PshAI,Rle
AI,SacII,SanDI,SfiI,SgfI,SgrAI,SmaI,SnaI,SnaBI,SpeI,SrfI,Sse8647I,StuI,StySQ,SwaI,Uba1220I,Uba1221I,Uba1382I,UbaD
I,Van91I,XmaI
b. 切割 pUCm-T 載體一次的限制性內切酶
497AacI,2708AatII,517AccI,408Acc65I,503AcrI,515Acs1371I,893AflIII,2263AflIV,503AhyAI,1309AlwNI,186ApaBI,396ApoI,
443Apu16I,533Asp52I,527Asp5HI,455AteI,504AvaI,498BamHI,406BanII,239BbeI,234BbeAI,534BbrI,2291BcgI,2325BcgI'
492Bco63I,492BglII,1852Bli49I,1847BsaI,756BsaXI,497BsaBI,117BsbI,449BshLI,462BsoDI,401Bsp117I,407BspJ106I,893
BspLU11I,529BspMI,455Bst224I,1866Cfr10I,515ChuII,445ClaI,456DsaI,515DsaVI,401Ecl137I,1786EclHKI,463Eco52I,39
5Eco82I,397EcoDR2,404EcoICRI,2443EcoKI,2762EcoO109I,396EcoRI,452EcoRV,541EcoprrI,237EheI,50Esp16I,45Esp3
I,474FsuI,518HincII,534HindIII,235KasI,412KpnI,236NarI,456NcoI,508Nli387/7I,463NotI,1801Pfl1108I,2703Ppu1253I,276
5PssI,406SacI,516SalI,777SapI,2266ScaI,506SciI,476SexAI,532SphI,526Sse8387I,2590SspI,456StyI,158StySJ,2443Sty
SPI,2380SynII,478Tth111I,1490Tth111II,2760Uba1326,510XbaI,484XcmI,504XhoI,2385XmnI.
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