長片段 PCR 擴增試劑盒
產品編號： B639285
包裝規格： 50 rnx/ 100 rnx
試劑盒組成
組分 50 rnx 100 rnx
10X Long PCR Buffer 0.5 ml 1 ml
25 mM MgSO4 Solution 0.5 ml 1 ml
10 mM dNTP Mix 0.06 ml 0.12 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 0.25 ml 0.5 ml
Long and Accurate Enzyme, 5 U/µl 25 µl (125 U) 50 µl (250 U)
Sterilized ddH2O 1 ml 2 ml
操作手冊 1 1
保存方法及穩定性
4°C 運輸， -20°C 保存。避免反復凍融。
產品介紹
Long and Accurate PCR Kit 用于擴增大于或等于 5 kb 的片段。試劑盒中最重要的組分是 Long and Accurate Enzyme，
由 Taq DNA 酶和具有校對活性的熱穩定 DNA 聚合酶組合而成。這種酶的主要特點包括兩方面，一個是使用人類基因組 DNA
模板時產物可達 20 kb，使用病毒基因組模板時產物可達 40 kb；另一個是比 Taq DNA 聚合酶保真性高。Long PCR Buffer
可保護 DNA 在長期熱循環中免受損傷。
10xLong PCR Buffer 含有 20 mM MgSO4，在反應體系中 MgSO4 終濃度為 2 mM MgSO4。如果需要更高濃度的 Mg2+，
請用 long and accurate PCR kit 提供的 25 mM MgSO4 溶液調整 Mg2+濃度。
標準操作步驟
1. 模板DNA
在 50 µl 反應體系中使用 1~10 ng 的質粒或噬菌體 DNA，或 0.1~1 µg 的基因組 DNA。高質量和完整的模板 DNA 是長
片段 PCR 擴增的關鍵。損傷的 DNA 可能會得不到目的 PCR 產物。基因組 DNA 可通過磁珠法 DNA 抽提試劑盒獲得，無需
離心過程。另外，請將模板 DNA 分裝成小分存儲，避免反復凍融。降解的模板 DNA 不適合用來擴增長的目的片度。
2. 引物濃度
在一次 PCR 中引物的終濃度大約為 0.1~0.5 µM。PCR 產物小于或等于 10 kb 時，引物的終濃度為 0.1 µM。長片段的引
物設計原則和普通引物設計原則相似。主要不同在于引物應為 28~35 個核苷酸的長度。
3. 冰上溶解各組分并短暫離心。
4. 根據以下實驗方案準備反應體系：
10X Long PCR Buffer 5 µl
10 mM dNTP Mix 1 µl
Forward primer 0.1~0.5 µM
Sangon Biotech
Reverse primer 0.1~0.5 µM
Template DNA 1 ng~1 µg
Long and Accurate Enzyme 1.25~2.5 U
Sterilized ddH2O 補足至 50 µl
注意：
如果 PCR 產物 GC 含量高，請加入 2 µl DMSO 到 50 µl PCR 反應體系中；
如果 PCR 產物大于 20 kb，dNTP Mix 終濃度是 0.3 mM；
請在最后加入 Long and Accurate Enzyme 并直接開始 PCR。
PCR 產物小于等于 15 kb，則 50 µl 使用 1.25 U long and accurate enzyme；PCR 產物大于>15 kb，每 50 µl 使用量最多為
2.5 U。
5. 將反應管放入離心機，離心30-60 s；
6. 若使用的熱循環儀無熱蓋功能，則用礦物油將PCR混合液覆蓋。
7. 樣品放入PCR儀中，并根據以下循環程序直接開始PCR。
步驟 溫度，°C 時間 循環數
預變性 94 2 min 1
變性 94 20 s
退火 Tm-5 30 s 10
延伸 68 1 min/kb
變性 94 20 s
退火 Tm 20~25 -5 30 s
延伸 68 1min/kb+X s/cycle
終延伸 68 10 min 1
保存 4 N.A. N.A.
根據下表計算延伸時間：
PCR 片段長度，kb 10 15 20 25 30 35 40
延伸時間，min 8 15 20 20 23 25 27
每個循環需要增加的時間，X s/cycle 5 5 10 10 15 15 20
應用案例
1. 擴增Enterobacteriaλ噬菌體基因組DNA區域(20kb)
2. 根據以下實驗方案準備反應體系：
10xLong PCR Buffer 5 µl
dNTP Mix (10 mM) 1 µl
Lambda 20kF (10 µM) 0.5 µl
Lambda 20kR (10 µM) 0.5 µl
Lambda DNA (2 ng/µl) 0.5 µl
Long and Accurate Enzyme 0.25 µl
Sangon Biotech
Sterilized ddH2O 補足至 50 µl
3. 將反應管放入離心機并離心30–60 s。
4. 將樣品放入循環儀中并根據下列循環程序直接開始PCR。
步驟 溫度°C 時間 循環次數
Initial Denaturation 94 2 min 1
Denaturation 94 20 s
Annealing 63 30 s 10
Extension 68 20 min
Denaturation 94 20 s
Annea 20 ling 63 30 s
Extension 68 20 min+10 s/cycle
Final Extension 68 10 min 1
Hold 4 N.A. N.A.
5. PCR 產物通過0.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖1）
M: Marker SM0101;
1: lambda 20kb
圖 1 20kb PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳
常見問題指南
可能原因 意見& 建議
產物少或沒有
模板 DNA 不足 根據標準操作步驟提高 PCR 中模板 DNA 的含量。
模板質量差
始終使用純化、完整的高質量 DNA 作為模板。用瓊脂糖凝膠電泳分析模板的
完整性。將模板 DNA 分裝儲存，避免反復凍融。
困難模板
如果模板 DNA 的 GC 含量高，反應體系中加入 4% DMSO 將有助于反應。此
外，每 50 μl PCR 反應體系中建議使用高達 2.5 U 的酶濃度。
熱循環相關問題 檢查是否正確設置了熱循環程序，以 5 個循環數為增量提高循環次數。
Sangon Biotech
可能原因 意見& 建議
引物濃度過低 使用引物終濃度為 0.1~0.5 μM。
Mg2+濃度不是最優 優化并調整 Mg2+濃度。
產物多條帶
引物設計不完善 檢查引物設計及其特異性。
引物降解 檢查引物溶液濃度和質量。
退火溫度過低 提高退火溫度。進行梯度 PCR，找到最優的退火溫度。
循環數太多 減少循環次數以排除非特異性產物。
模板太多
擴增病毒或質粒 DNA 時，每 50 μl PCR 體系的初始模板濃度不應超過 10 ng；
擴增基因組 DNA 時，每 50 μl PCR 體系的初始模板濃度不應超過 1 μg。
產物被污染
起始模板太多 減少模板 DNA 的量。
循環數太多 以 5 個循環數為增量減少循環次數
延伸時間過長 以 2 分鐘為增量減少延伸時間
Mg2+ 濃度不是最優 優化并調整 Mg2+濃度
酶過量 確保每 50 μl PCR 體系中加入的酶含量等于或少于 2.5 U。
攜帶污染 純化 DNA 模板。使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶以防止攜帶污染。
我要詢價
*聯系方式：
(可以是QQ、MSN、電子郵箱、電話等，您的聯系方式不會被公開)
*內容：
