禽流感病毒 H5 和 H7 亞型雙重實時熒光
RT-PCR 檢測試劑盒使用說明書
用途 本試劑盒采用實時熒光 RT-PCR 方法檢測禽組織、分泌物、排泄物及尿囊液中禽流感病毒 H5
（AIV-H5）和 H7 亞型（AIV-H7）的 RNA，適用于 AIV-H5、AIV-H7 的檢測、診斷和流行病學調查。 原理 利用離心柱內硅基質膜提取樣品總 RNA，在高效反轉錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引 物為起點合成與 RNA 模板互補的 cDNA 鏈。在熱啟動 Taq 酶的作用下，經高溫變性、中溫退火及 延伸的循環，使特異 DNA 片段的拷貝數放大一倍，經熒光素標記的探針與擴增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報告基團與淬滅基團分離，發出特異性熒光信號，利用 熒光 PCR 儀檢測特異性熒光信號，根據樣品 Ct 值的大小及擴增曲線的形成情況判定結果。
試劑盒組成
| 名稱 | 50 頭份 | 貯藏條件 |
| 裂解液 | 30 mL |
室溫（A 盒） |
| 洗液 | 60 mL | |
| 洗脫液 | 10 mL | |
| 吸附柱和收集管 | 50 套 | |
| 陰性對照 | 1 mL |
-20 ℃（B 盒） |
| 陽性對照 | 600 µL | |
| 無菌無核酸酶水 | 600 µL | |
| RT-PCR 反應液 | 600 µL | |
| 酶混合液 | 25 µL | |
| 熒光探針 | 140 µL |
保存期本產品有效期為 12 個月。
需要自備的器材
1．儀器：分析天平、離心機、熒光 PCR 擴增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調移液器（2 µL、20
µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 專用反應管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 經焦碳酸二乙酯（DEPC）水 處理的滅菌離心管、吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、滅菌雙蒸水。
使用注意事項
1．所有接觸病料的物品均應合理處置，以免污染實驗室。
2．PCR 整個試驗分配液區、模板提取區、擴增區。流程順序為配液區→模板提取區→擴增區。嚴 禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應在規定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應完全融化，8000 rpm 離心 15 s， 使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立 即放回-20 ℃。
4．在 RNA 提取過程中，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時間。
5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
6．嚴格遵守操作說明可以獲得最好的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
7．反應體系應在特定配液區或者超凈工作臺中配制，整個實驗過程嚴格控制污染。
8．反復凍融試劑將降低檢測靈敏度，本試劑盒應在 3 次內用完，請嚴格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸 道分泌物或排泄物，置于 50%甘油生理鹽水中。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮， 嚴禁反復凍融。）
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術剪剪碎混勻后取 0.02 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
操作步驟
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～
5 min。
1.2 將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質，以免離心時 堵塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s。
1.3 棄去收集管中液體，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。
1.4 重復步驟 1.3。
1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。
1.6 將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min，13000 rpm
離心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA。
2 實時熒光 RT-PCR 操作
設被檢樣品、陰性對照和陽性對照總和為 N，每份總體積 20µL，反應體系配制如下：
| 試劑 | 體系 |
| 無菌無核酸酶水 | 2.3（N+1）µL |
| RT-PCR 反應液 | 10（N+1）µL |
| 酶混合液 | 0.4（N+1）µL |
| 熒光探針 | 2.3（N+1）µL |
將以上配制的反應體系充分混勻后，分裝每個反應管中各 15 µL。
分別取 5 µL 模板 RNA，加入相應反應管中，混勻并作好標記，其中 AIV-H7 熒光報告基團為 FAM，AIV-H5 為 HEX，淬滅基團均為 None（如果儀器沒有 HEX 校正過，可暫時用 VIC 代替）。在 熒光 PCR 儀上進行以下反應：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每個循環第二步
（60℃ 35s）收集熒光信號，共 40 個循環。
結果判定
1 結果分析條件設定 閾值設定原則：閾值線設定于剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點。不同儀器可根據儀器噪音
情況進行調整。
2 結果描述及判定
陽性對照 Ct 值≤30 并出現特定的擴增曲線，陰性對照無 Ct 值并且無特定擴增曲線，實驗結 果成立；被檢樣品若 FAM 熒光信號 Ct 值≤30 并出現特定的擴增曲線為 H7 陽性；被檢樣品若 Hex 熒光信號 Ct 值≤30 并出現特定的擴增曲線為 H5 陽性；被檢樣品 30＜Ct＜35 并出現特定的擴增曲線， 需重新取樣提取 RNA，擴增后進行結果判定，如仍是可疑，可判定為陽性；被檢樣品 Ct 值≥35 時， 超過本方法檢測靈敏度范圍，判定為陰性；對于某些未呈現 S 型曲線，但本底較高的樣品，應為陰 性。
