正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義
3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)試劑盒說明書GAPDH 催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關鍵酶，與糖異生途徑、體內血糖濃度的維持和糖尿病的發生密切相關，在機體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發揮重要作用。
試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存； 試劑三：液體 14uL×1 支，4℃保存； 組織樣本的前處理
①總 GAPDH 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰
浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定。
②胞漿和葉綠體 GAPDH 酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃，8000g 離心 10min，取上清用于測定胞漿 GAPDH 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定葉綠體中 GAPDH 酶活性。
建議測定總 GAPDH 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的
GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。
細菌或培養細胞的前處理
先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2、 樣本測定
測定原理
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3 二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3 二磷酸甘油酸和 NADH 生成 3 磷酸甘油醛、無機磷和NAD，340nm 處測定 NADH 的減少量可反映GADPH 活性的高低。需自備的儀器和用品
分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的組成和配制
提取液一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。提取液二：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存； 試劑三：液體 14uL×1 支，4℃保存； 組織樣本的前處理
①總 GAPDH 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰
浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定。
②胞漿和葉綠體 GAPDH 酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃，8000g 離心 10min，取上清用于測定胞漿 GAPDH 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定葉綠體中 GAPDH 酶活性。
建議測定總 GAPDH 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的
GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。
細菌或培養細胞的前處理
先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟
1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。2、 樣本測定
- 工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或 25℃( 其它物種)預熱 10 分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
- 在試劑三中加入 500μL 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
- 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 樣本、5μL 試劑三和 190μL 工作液，混勻，加入最后一個試劑的同時開始計時，記錄 340nm 處20s 時的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A1-A2。
GAPDH 活性計算
- 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
- 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
- 按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W
- 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2.572×ΔA V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。
- 用 96 孔板測定的計算公式如下
- 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr
- 按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2572×ΔA÷W
- 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=5.144×ΔA V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL； T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。
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