產(chǎn)品概述 product description
葉綠體是植物細(xì)胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，光合作用就是在葉綠體中進(jìn)行的, 由于具有這一重要功能，所以葉綠體一直是細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的重要研究對(duì)象。葉綠體是植物細(xì)胞中較大的一種細(xì)胞器。跨膜蛋白承擔(dān)各種生物功能，在生物的各種發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。膜蛋白樣品的制備需要充分考慮到與下游的膠分析及質(zhì)譜分析等應(yīng)用配套，因此膜蛋白樣本制備成為一個(gè)難以逾越的挑戰(zhàn)。 葉綠體膜蛋白提取試劑盒用簡(jiǎn)便快速的方法可以從各種植物樣本中提取葉綠體膜蛋白，提取過(guò)程簡(jiǎn)單方便，可在一小時(shí)內(nèi)提取得到高質(zhì)量的葉綠體膜蛋白。該試劑盒含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對(duì)蛋白的降解，為提取高質(zhì)量的蛋白提供了保證。 本試劑盒含有的獨(dú)特配方能夠有效溶解膜組份。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對(duì)蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。 本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酶活性測(cè)定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。 本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白
保存溫度
2-8℃
注意事項(xiàng)
1.蛋白酶抑制劑未開(kāi)蓋使用前也可以2-8℃儲(chǔ)存。開(kāi)蓋使用后-20℃儲(chǔ)存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。
3.試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。
3.試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！
有效期
一年
檢測(cè)方法
WB,IP等
適用樣本
植物
產(chǎn)品特點(diǎn)
1.使用方便。
2.含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。
3.紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。
4.蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性。
2.含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。
3.紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。
4.蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性。
產(chǎn)品應(yīng)用
WB,IP等
儀器準(zhǔn)備
1.離心機(jī)
2.振蕩器
3.渦旋混勻器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
2.振蕩器
3.渦旋混勻器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
試劑準(zhǔn)備
1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒
2.蛋白定量試劑盒
耗材準(zhǔn)備
1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
2.吸頭
3.一次性手套
使用注意事項(xiàng)
使用注意事項(xiàng)：
旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。
操作時(shí)必須按照下面步驟里的溫度條件，否則嚴(yán)重影響膜蛋白的回收率。
提取液B在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時(shí)會(huì)導(dǎo)致不容易分層。
膜蛋白電泳時(shí)loading buffer應(yīng)該避免煮沸。
膜蛋白電泳時(shí)可以提高loading buffer的SDS含量。
旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。
操作時(shí)必須按照下面步驟里的溫度條件，否則嚴(yán)重影響膜蛋白的回收率。
提取液B在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時(shí)會(huì)導(dǎo)致不容易分層。
膜蛋白電泳時(shí)loading buffer應(yīng)該避免煮沸。
膜蛋白電泳時(shí)可以提高loading buffer的SDS含量。
使用方法
1. 提取液制備：
每500 μl冷的蛋白提取液C中加入2 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取500 mg-1 g新鮮植物葉片樣本，用純水洗凈擦干后去除葉梗和粗脈，用手術(shù)剪刀或鋒利的刀片剪切碎，切成0.5 mm*0.5 mm細(xì)塊。
3. 加入500 μl提取液A，充分混勻。
4. 將懸液置振蕩器上室溫振蕩12-72小時(shí)。
5. 在1000×g條件下離心5-10分鐘，棄上清，收集沉淀。
6. 在沉淀中加入2 ml提取液B用組織攪碎機(jī)/勻漿機(jī)/Dounce勻漿器充分勻漿。
7. 將勻漿用100 um細(xì)胞篩過(guò)濾。
8. 將濾液500×g力離心3分鐘。將上清移入另一干凈離心管。
9. 將上清3000×g力離心10分鐘。棄上清，收集沉淀。
10. 在沉淀中加入500 μl蛋白提取液C，充分混勻。 在2-8℃條件下振蕩1小時(shí)。
11. 將提取液在4℃，12000×g條件下離心5分鐘，取上清。
12. 在37℃水浴10分鐘。
13. 在37℃ ，500-1000×g離心3分鐘。
14. 此時(shí)溶液分為兩層，小心移除上層，保留下層溶液，大約30-50μl。
15. 用50-150 μl冷的膜蛋白溶解液溶解下層溶液，即得葉綠體膜蛋白。
16. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛘{(diào)整相應(yīng)的濃度后直接用于下游實(shí)驗(yàn)。
每500 μl冷的蛋白提取液C中加入2 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取500 mg-1 g新鮮植物葉片樣本，用純水洗凈擦干后去除葉梗和粗脈，用手術(shù)剪刀或鋒利的刀片剪切碎，切成0.5 mm*0.5 mm細(xì)塊。
3. 加入500 μl提取液A，充分混勻。
4. 將懸液置振蕩器上室溫振蕩12-72小時(shí)。
5. 在1000×g條件下離心5-10分鐘，棄上清，收集沉淀。
6. 在沉淀中加入2 ml提取液B用組織攪碎機(jī)/勻漿機(jī)/Dounce勻漿器充分勻漿。
7. 將勻漿用100 um細(xì)胞篩過(guò)濾。
8. 將濾液500×g力離心3分鐘。將上清移入另一干凈離心管。
9. 將上清3000×g力離心10分鐘。棄上清，收集沉淀。
10. 在沉淀中加入500 μl蛋白提取液C，充分混勻。 在2-8℃條件下振蕩1小時(shí)。
11. 將提取液在4℃，12000×g條件下離心5分鐘，取上清。
12. 在37℃水浴10分鐘。
13. 在37℃ ，500-1000×g離心3分鐘。
14. 此時(shí)溶液分為兩層，小心移除上層，保留下層溶液，大約30-50μl。
15. 用50-150 μl冷的膜蛋白溶解液溶解下層溶液，即得葉綠體膜蛋白。
16. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛘{(diào)整相應(yīng)的濃度后直接用于下游實(shí)驗(yàn)。
常見(jiàn)問(wèn)題分析
1.蛋白濃度低？
處理部分組織樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解完全，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長(zhǎng)試劑AB的處理時(shí)間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒(méi)有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
2.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭┲泻懈蓴_Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過(guò)透析處理或者用脫鹽柱改換過(guò)緩沖體系，則可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。
4.膜蛋白電泳沒(méi)有條帶？
膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進(jìn)行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超聲處理一下，再進(jìn)行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。
蛋白Loading buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。
有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。
電泳時(shí)最后采用低電壓低電流電泳。
處理部分組織樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解完全，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長(zhǎng)試劑AB的處理時(shí)間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒(méi)有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
2.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭┲泻懈蓴_Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過(guò)透析處理或者用脫鹽柱改換過(guò)緩沖體系，則可以用Bradford法定量。
3.提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。
4.膜蛋白電泳沒(méi)有條帶？
膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進(jìn)行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超聲處理一下，再進(jìn)行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。
蛋白Loading buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。
有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。
電泳時(shí)最后采用低電壓低電流電泳。
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