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pCMV-Cre-mCherry

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 pCMV-Cre-mCherry是自行研發的含有CMV啟動子的用于在哺乳動物細胞中表達帶有mCherry (DsRed的突變體,一種非常明亮的紅色熒光蛋白)標簽的Cre Recombinase (Cre重組酶)的表達質粒。來自條件性基因敲除(conditional knockout) 小鼠等含有預先插入loxP位點的細胞在轉染本質粒后,本質粒表達的Cre Recombinase可以導致兩個loxP位點間的基因刪除,從而實現條件性基因敲除(conditional gene knockout)。

Cre重組酶是來源于大腸桿菌噬菌體P1的一種類型I的拓樸異構酶(Type I topoisomerase),也是一種酪氨酸重組酶(tyrosine recombinase),它可識別34bp的loxP位點(兩端為兩個13bp的反向重復序列(inverted repeats),中間是8bp的間隔區(圖1)并催化loxP位點之間的DNA發生重組;重組產物根據loxP位點的位置和相對方向的不同而不同,兩個含單loxP位點的DNA將發生融合:兩個正向重復的loxP位點間的DNA將以環狀形式被切割,而兩個反向loxP位點間的DNA序列將被翻轉(圖2)。

圖1. loxP位點序列圖。Cre重組酶與兩端13bp反向重復序列(小寫字母)結合,中間是8bp不對稱中心間隔區(大寫字母),箭頭所示為Cre重組酶的酶切位點。

圖2. Cre-loxP位點特異性重組示意圖。

pCMV-Cre-mCherry質粒轉染HeLa細胞后的熒光表達效果,可以看到mCherry標簽的Cre重組酶主要分布在細胞核中(圖3)。

圖3. pCMV-Cre-mCherry質粒轉染HeLa細胞后的表達效果圖。左圖為明場照片,中圖為熒光照片,右圖為疊加照片。

本質粒為卡那霉素抗性,轉染細胞后,可使用G418篩選穩定表達目的蛋白的細胞株。

pCMV-Cre-mCherry質粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 1-602
T3 promoter and T3 primer binding site 620-639
Cre recombinase 677-1705
mCherry 1718-2428
multiple cloning site 2340-2488
T7 promoter and T7 primer binding site 2532-2553
SV40 polyA signal 2565-2948
f1 origin of ss-DNA replication 3086-3390
bla promoter 3415-3539
SV40 promoter 3559-3897
neomycin/kanamycin resistance ORF 3932-4723
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 4724-5182
pUC origin 5311-5978

pCMV-Cre-mCherry質粒(6030bp)的圖譜如下:

pCMV-Cre-mCherry中沒有的酶切位點(Restriction enzymes that do not cut pCMV-Cre-mCherry)包括:

AflII AscI BaeI BlpI BmgBI BsiWI BspEI
BspQI BstXI BstZ17I EarI EcoNI FseI NotI
PmeI PmlI PpuMI PspXI SacII SapI ScaI
SmaI SrfI SwaI TspMI XmaI    

pCMV-Cre-mCherry中的單酶切位點(Restriction enzymes that cut pCMV-Cre-mCherry)包括:

AccI GT`MK,AC 2454 Esp3I CGTCTCN`NNNN, 1360
AclI AA`CG,TT 1047 HindIII A`AGCT,T 2430
AfeI AGC|GCT 660 HpaI GTT|AAC 2825
AhdI GACNN,N`NNGTC 1911 MfeI C`AATT,G 2812
AleI CACNN|NNGTG 2360 MluI A`CGCG,T 2948
ApaI G,GGCC`C 2488 NdeI CA`TA,TG 240
AsiSI GCG,AT`CGC 1133 NheI G`CTAG,C 597
BamHI G`GATC,C 1032 NruI TCG|CGA 891
BbsI GAAGACNN`NNNN, 2153 PaeR7I C`TCGA,G 2465
BbvCI CC`TCA,GC 2256 PaqCI CACCTGCNNNN`NNNN, 1286
BcgI ,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` 1079 PflFI GACN`N,NGTC 4178
BclI T`GATC,A 2719 PflMI CCAN,NNN`NTGG 2154
BglII A`GATC,T 2460 PshAI GACNN|NNGTC 1512
BmtI G,CTAG`C 597 PspOMI G`GGCC,C 2483
BsaI GGTCTCN`NNNN, 5049 SacI G,AGCT`C 651
BsgI GTGCAG(N)14,NN` 2310 SalI G`TCGA,C 2454
BsmBI CGTCTCN`NNNN, 1360 SbfI CC,TGCA`GG 2069
BsrGI T`GTAC,A 2418 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3832
BssHII G`CGCG,C 918 SgrAI CR`CCGG,YG 2399
BtsI GCAGTG,NN` 2899 SpeI A`CTAG,T 2478
CspCI ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 380 Tth111I GACN`N,NGTC 4178
DraIII CAC,NNN`GTG 3175 XbaI T`CTAG,A 2472
EagI C`GGCC,G 3966 XcmI CCANNNN,N`NNNNTGG 2403
Eco53I GAG|CTC 653 XhoI C`TCGA,G 2466
EcoRI G`AATT,C 2442 XmnI GAANN|NNTTC 885

如需對pCMV-Cre-mCherry質粒中插入片段Cre-mCherry進行測序時,推薦使用的正向測序引物T3和反向測序引物T7的序列如下:

T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'

T7 primer (2532-2553): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'

包裝清單:
產品編號 產品名稱 包裝
D2607-1µg pCMV-Cre-mCherry 1μg
D2607-100µg pCMV-Cre-mCherry 100μg
說明書 1份
保存條件:

-20℃保存。

注意事項:

本質粒未經書面許可不得用于任何商業用途,也不得移交給訂貨人所在實驗室外的任何個人或單位。

本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明:
1.首次使用1µg包裝的本產品時,請先取少量本質粒轉化大腸桿菌,進行質粒小量、中量或大量抽提后再用于后續用途。抽提獲得的質?梢酝ㄟ^酶切電泳進行鑒定,或通過測序進行鑒定。
2.100µg包裝的本產品質粒濃度為0.1µg/µl,共1ml?梢灾苯佑糜诿盖谢蛘咿D染細胞。

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