pCMV-Cre-mCherry是自行研發的含有CMV啟動子的用于在哺乳動物細胞中表達帶有mCherry (DsRed的突變體,一種非常明亮的紅色熒光蛋白)標簽的Cre Recombinase (Cre重組酶)的表達質粒。來自條件性基因敲除(conditional knockout) 小鼠等含有預先插入loxP位點的細胞在轉染本質粒后,本質粒表達的Cre Recombinase可以導致兩個loxP位點間的基因刪除,從而實現條件性基因敲除(conditional gene knockout)。
Cre重組酶是來源于大腸桿菌噬菌體P1的一種類型I的拓樸異構酶(Type I topoisomerase),也是一種酪氨酸重組酶(tyrosine recombinase),它可識別34bp的loxP位點(兩端為兩個13bp的反向重復序列(inverted repeats),中間是8bp的間隔區(圖1)并催化loxP位點之間的DNA發生重組;重組產物根據loxP位點的位置和相對方向的不同而不同,兩個含單loxP位點的DNA將發生融合:兩個正向重復的loxP位點間的DNA將以環狀形式被切割,而兩個反向loxP位點間的DNA序列將被翻轉(圖2)。
圖1. loxP位點序列圖。Cre重組酶與兩端13bp反向重復序列(小寫字母)結合,中間是8bp不對稱中心間隔區(大寫字母),箭頭所示為Cre重組酶的酶切位點。圖2. Cre-loxP位點特異性重組示意圖。
pCMV-Cre-mCherry質粒轉染HeLa細胞后的熒光表達效果,可以看到mCherry標簽的Cre重組酶主要分布在細胞核中(圖3)。
圖3. pCMV-Cre-mCherry質粒轉染HeLa細胞后的表達效果圖。左圖為明場照片,中圖為熒光照片,右圖為疊加照片。
本質粒為卡那霉素抗性,轉染細胞后,可使用G418篩選穩定表達目的蛋白的細胞株。
pCMV-Cre-mCherry質粒的主要信息如下:
Feature Nucleotide | Position |
CMV promoter | 1-602 |
T3 promoter and T3 primer binding site | 620-639 |
Cre recombinase | 677-1705 |
mCherry | 1718-2428 |
multiple cloning site | 2340-2488 |
T7 promoter and T7 primer binding site | 2532-2553 |
SV40 polyA signal | 2565-2948 |
f1 origin of ss-DNA replication | 3086-3390 |
bla promoter | 3415-3539 |
SV40 promoter | 3559-3897 |
neomycin/kanamycin resistance ORF | 3932-4723 |
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal | 4724-5182 |
pUC origin | 5311-5978 |
pCMV-Cre-mCherry質粒(6030bp)的圖譜如下:
pCMV-Cre-mCherry中沒有的酶切位點(Restriction enzymes that do not cut pCMV-Cre-mCherry)包括:
AflII | AscI | BaeI | BlpI | BmgBI | BsiWI | BspEI |
BspQI | BstXI | BstZ17I | EarI | EcoNI | FseI | NotI |
PmeI | PmlI | PpuMI | PspXI | SacII | SapI | ScaI |
SmaI | SrfI | SwaI | TspMI | XmaI |
pCMV-Cre-mCherry中的單酶切位點(Restriction enzymes that cut pCMV-Cre-mCherry)包括:
AccI | GT`MK,AC | 2454 | Esp3I | CGTCTCN`NNNN, | 1360 |
AclI | AA`CG,TT | 1047 | HindIII | A`AGCT,T | 2430 |
AfeI | AGC|GCT | 660 | HpaI | GTT|AAC | 2825 |
AhdI | GACNN,N`NNGTC | 1911 | MfeI | C`AATT,G | 2812 |
AleI | CACNN|NNGTG | 2360 | MluI | A`CGCG,T | 2948 |
ApaI | G,GGCC`C | 2488 | NdeI | CA`TA,TG | 240 |
AsiSI | GCG,AT`CGC | 1133 | NheI | G`CTAG,C | 597 |
BamHI | G`GATC,C | 1032 | NruI | TCG|CGA | 891 |
BbsI | GAAGACNN`NNNN, | 2153 | PaeR7I | C`TCGA,G | 2465 |
BbvCI | CC`TCA,GC | 2256 | PaqCI | CACCTGCNNNN`NNNN, | 1286 |
BcgI | ,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` | 1079 | PflFI | GACN`N,NGTC | 4178 |
BclI | T`GATC,A | 2719 | PflMI | CCAN,NNN`NTGG | 2154 |
BglII | A`GATC,T | 2460 | PshAI | GACNN|NNGTC | 1512 |
BmtI | G,CTAG`C | 597 | PspOMI | G`GGCC,C | 2483 |
BsaI | GGTCTCN`NNNN, | 5049 | SacI | G,AGCT`C | 651 |
BsgI | GTGCAG(N)14,NN` | 2310 | SalI | G`TCGA,C | 2454 |
BsmBI | CGTCTCN`NNNN, | 1360 | SbfI | CC,TGCA`GG | 2069 |
BsrGI | T`GTAC,A | 2418 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 3832 |
BssHII | G`CGCG,C | 918 | SgrAI | CR`CCGG,YG | 2399 |
BtsI | GCAGTG,NN` | 2899 | SpeI | A`CTAG,T | 2478 |
CspCI | ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` | 380 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 4178 |
DraIII | CAC,NNN`GTG | 3175 | XbaI | T`CTAG,A | 2472 |
EagI | C`GGCC,G | 3966 | XcmI | CCANNNN,N`NNNNTGG | 2403 |
Eco53I | GAG|CTC | 653 | XhoI | C`TCGA,G | 2466 |
EcoRI | G`AATT,C | 2442 | XmnI | GAANN|NNTTC | 885 |
如需對pCMV-Cre-mCherry質粒中插入片段Cre-mCherry進行測序時,推薦使用的正向測序引物T3和反向測序引物T7的序列如下:
T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'
T7 primer (2532-2553): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'
包裝清單:產品編號 | 產品名稱 | 包裝 |
D2607-1µg | pCMV-Cre-mCherry | 1μg |
D2607-100µg | pCMV-Cre-mCherry | 100μg |
— | 說明書 | 1份 |
-20℃保存。
注意事項:本質粒未經書面許可不得用于任何商業用途,也不得移交給訂貨人所在實驗室外的任何個人或單位。
本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1.首次使用1µg包裝的本產品時,請先取少量本質粒轉化大腸桿菌,進行質粒小量、中量或大量抽提后再用于后續用途。抽提獲得的質?梢酝ㄟ^酶切電泳進行鑒定,或通過測序進行鑒定。
2.100µg包裝的本產品質粒濃度為0.1µg/µl,共1ml?梢灾苯佑糜诿盖谢蛘咿D染細胞。