【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于禽流感病毒檢測，定性檢測禽流感病毒H5亞型，對禽流感病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗(yàn)原理】
利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35次循環(huán)，最終使擴(kuò)增DNA片段放大了數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增DNA片段進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到DNA片段的擴(kuò)增帶。
【主要組成成份】
| 序號 | 組成 | 50T/盒 |
| 1 | 禽流感H5 RT-PCR反應(yīng)液 | 750 μL×1管 |
| 2 | 禽流感H5 混合酶液 | 150 μL×1管 |
| 3 | 禽流感H5 陽性對照 | 40 μL×1管 |
| 4 | 禽流感H5 陰性對照 | 40 μL×1管 |
| 5 | 說明書 | 1份 |
注：陰性對照為禽類基因組DNA，陽性對照為失去活性的禽流感病毒H5亞型cDNA。
【儲存條件及有效期】-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
【需自備的物品】PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、可調(diào)移液器、瓊脂糖等相關(guān)試劑及設(shè)備。
【注意事項(xiàng)】
1.病毒具有很強(qiáng)的感染能力，操作前必須準(zhǔn)備好各種防御措施。
2.操作時(shí)須嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行，廢物必須放入含消毒液的廢物缸，以免污染實(shí)驗(yàn)室和工作人員。
3.為避免其他核酸的污染而出現(xiàn)假陽性，必須使用不含DNA和RNA的離心管、吸管、槍頭、試劑和手套，操作人員須戴口罩。
【實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備】
如果是提取病毒RNA，請選用RNase free Tip槍頭和1.5 ml離心管或?qū)岊^和離心管用0.1% DEPC水處理后再使用。
【操作步驟】
1.樣品處理：每份樣品分別處理。
（1）無細(xì)胞體液樣品處理：收集200 µL樣品，轉(zhuǎn)入到1.5 ml離心管中；
（2）全血樣品處理：待血凝后取血清 200 µL , 轉(zhuǎn)入到1.5 ml離心管中；
（3）組織樣品處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g ，用手術(shù)剪碎混勻后取 ，用手術(shù)剪碎混勻后取 0.05 g于研磨器中，加入1.5 mL生理鹽水繼續(xù)充分研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL 滅菌離心管中，12,000 rpm離心 5 min，取上清液 200 µL 于1.5 mL離心管中。
2. 提取過程
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3. RT-PCR擴(kuò)增
（1）每份總體積20 µL，含15 µL RT-PCR反應(yīng)液（用前混勻），3µL 混合酶液，2 µL模板RNA。
例如：n份樣品，配制n+1份，15×（n+1）RT-PCR反應(yīng)液， 3×（n+1）混合酶液勻后取18 µL分裝成n份，分別加入2 µL模板RNA，作好標(biāo)記。
（2）在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：50 ℃ 10 min，94 ℃ 3 min；循環(huán)94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。
4. 電泳
稱1.5 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中，加入1倍TAE電泳緩沖液100 mL（取2 mL 50倍TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至100 mL），于微波爐中熔解，待冷卻至50℃左右再加入50 µL染色液（自備）混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4µL上樣緩沖液（自備）混勻后取10 µL點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120V電壓于1倍TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。（注：染色液是2000×，上樣緩沖液是6×）
【結(jié)果判定】
陽性對照出現(xiàn)219 bp擴(kuò)增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)219 bp擴(kuò)增帶為禽流感病毒H5亞型陽性，否則為陰性。
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