| 產品及特點 | 本試劑盒是基于沙門氏噬菌體T3 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉錄試劑盒，它利用含有 T3 啟動子的模版DNA，以 NTP 為底物，從 T3 啟動子下游開始合成與模板 DNA 中一條鏈互補的RNA，簡單快速獲得大量的 RNA 分子。本產品具有下列特點： 1. 即開即用，用戶只需提供含 T3 啟動子的 DNA 模板即可以進行體外轉錄實驗，不需單獨準備每一個成份。 2. 單溶液預配液，減少加樣次數，避免了操作誤差，增加了可重復性。 3. 模板 DNA 可以是線性化的質粒 DNA，也可以是 PCR 擴增產物。 4. 可以合成的 RNA 的最佳長度在 20 nt 到 5000 nt 之問。 5. 產品配方經過精心優化，每μg DNA 模板可以合成 2-6 μg RNA。 6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結構研究、核解生物化學、體外翻譯、RNA- 蛋白質相互作用、反義技術、SELEX 技術和 RNA 干擾（RNAi）等實驗。 | ||||
| 規格及成分 |
| 成份 | 編號 | 十孔盒包裝 |
|
| 2×T3 轉錄預配液 | 91108a | 0.5 mL（本色蓋） | |||
| T3 RNA 聚合酶混合液 | 120309 | 50 μL（紅色蓋） | |||
| RNase-free 水 | 80403 | 1 mL（亮黃蓋） | |||
| 使用手冊 | 91108sc | 1 份 | |||
| 運輸及保存 | 低溫運輸，-20℃保存, 有效期一年。 | ||||
| 自備試劑 | 如果需要去除轉錄產物中的DNA 模板，則需要RNase-free DNase 、Tris 飽 和酚、氯仿、微量核酸沉淀劑、RNase-free 75%乙醇（均可從本公司另購） | ||||
| 使用方法 | 一、制備 DNA 模板 PCR 片段和質粒 DNA 都可以用作體外轉錄的模板，但是必須注意以下幾點。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質粒 DNA，則必須先用適當的限制性內切酶切成線狀。二是需要轉錄的 DNA 序列的上游必須有 T3 啟動子。如果模板是 PCR 產物，則可以在設計引物時將 T3 啟動子序列 （5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T3 啟動子的載體，并且克隆位點必須位于 T3 啟動子下游。三是需要轉錄的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如選擇了Pst I 來線性化質粒），則最好用 T4 DNA 聚合酶修 平。四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質粒 DNA 的過程中 | ||||
一般要使用大量的RNase A，因此質粒 DNA 一般都有嚴重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，最好采取膠回收得方法回收質粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫，然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此判斷純化的DNA 模板是否有殘留RNase A。
二、體外轉錄反應
|
| 但所用試劑需另行購買，本試劑盒不提供。 1.在體外轉錄結束后，在反應體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase。 2.37℃保溫 15-30 分鐘。 3. 補水到 100 μL， 4. 用自備的等體積（100 μL）的Tris 飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的DNase 和 RNA 聚合酶。 5. 在上清中加 200 μL 自備的微量核酸沉淀劑（CAT#50903；用前需要搖晃混勻），振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。 6. 加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。 7. 短暫離心數秒，用槍頭吸棄上清。 8. 晾干半分鐘，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free 水中后立即使用或放-80℃長期保存。 |
| 答客問 | 1、沒有 RNA 產物。最常見原因是 DNA 模板有 RNase 污染，測試方法是將純化的有兩條典型 RNA 條帶的總 RNA 跟模板 DNA 一起保溫，再檢測 RNA 是否降解。本試劑盒緩沖液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase 污染嚴重，可能需要用戶補加 RNase inhibitor。 2、RNA 產量低。最常見的原因是 DNA 模板序列。在轉錄序列的第一個和第二個堿基最好都是G，在前 14 個堿基內避免有U 存在。 3、RNA 長度比預期的短。可能是模板序列中有T3 RNA 聚合酶的終止序列。可以改用 SP6 或 T7 體外轉錄試劑盒（啟動子也必須做相應的改變）。 4、RNA 長度比預計的長。T3 RNA 聚合酶跟Taq DNA 聚合酶一樣，有不依賴于模板的加尾功能，最多有一半的 RNA 可以帶一個或兩個堿基的尾巴。如果 RNA 長度比預計的長很多，使用的模板又是質粒 DNA，則可能是質粒DNA 線性化不徹底。 5、5’單磷酸還是三磷酸。如果使用 GTP，則得到的 RNA 是三磷酸，體外轉錄時如果保溫時間太長（如 12 小時），則有 50%的三磷酸會變成單磷酸。如果在轉錄體系中加入 GMP，則 T3 RNA 聚合酶將優先使用 GMP，所得RNA 產物中 5’端是單磷酸的比例將大大增加。 6、如何得到帶帽 RNA？需加入帶帽 NTP 類似物即可，NEB 提供 5 種供選擇。 |
| 關聯產品 | T7 體外轉錄試劑盒（CAT#:91106）、SP6 體外轉錄試劑盒（CAT#:91107） |
