環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑篩選試劑盒酶

產(chǎn)品描述：

我司研發(fā)的環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑篩選試劑盒(Cyclooxygenase 2 Inhibitor Screening Kit，也稱COX-2 Inhibitor Screening Kit)是一種利用熒光檢測(cè)， 簡(jiǎn)單、快速、靈敏地用于人COX-2抑制劑高通量篩選的試劑盒。

1、 環(huán)氧化酶(cyclooxygenase, COX)又稱前列腺素內(nèi)氧化酶合成酶(Prostaglandin-endoperoxide synthase, PTGS) ，是一種同時(shí)具有 環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性的雙功能酶。例如， COX的環(huán)氧化酶活性可以催化花生四烯(Arachidonic Acid, AA)轉(zhuǎn)化為前列腺 素G2(prostaglandin G2, PGG2)，而COX的過氧化氫酶活性又可以將前列腺素G2轉(zhuǎn)化為前列腺素H2(prostaglandin H2, PGH2)。

2、有兩種常見的COX，一種是組成性表達(dá)的COX- 1，另一種是誘導(dǎo)性表達(dá)的COX-2。哺乳動(dòng)物的COX- 1與COX-2的分子量相似， 分別是70和72KDa，其氨基酸序列有65%同源， 其中酶催化活性區(qū)域的氨基酸序列幾乎一致。COX- 1在很多組織中組成性表 達(dá)，在胃粘膜、腎臟等中高表達(dá)， 催化產(chǎn)生維持正常生理功能的前列腺素，從而參與血管舒縮、血小板聚集、胃粘膜血流、 胃黏液分泌及腎臟功能等的調(diào)節(jié)。COX-2在正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或表達(dá)很少， 僅在腦、腎臟和生殖器官等中有一定 水平的組成性表達(dá)。COX-2在巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞等發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)， 可以被誘導(dǎo)表達(dá)。例如受 炎性刺激物、損傷、有絲分裂原或致癌物質(zhì)等促炎介質(zhì)誘導(dǎo)后， COX-2的表達(dá)增高，從而參與多種病理生理過程。COX-3  是COX- 1的不同剪接體，和COX- 1相比，COX-3多保留了一個(gè)內(nèi)含子，在狗(dog)中該內(nèi)含子的長(zhǎng)度為93個(gè)堿基，而在人和小鼠中長(zhǎng)度為94個(gè)堿基，因此在狗中COX-3是有酶活性的，而人和小鼠中的COX-3由于移碼突變而沒有酶活性。

3、COX-2與炎癥和腫瘤等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此， COX-2的選擇性抑制劑成為藥物研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 1991年1月第一個(gè)真 正意義上的COX-2 選擇性抑制劑塞來昔布(Celecoxib) 經(jīng)美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市， 同年5 月第二個(gè)選擇性抑制劑羅非昔布 (Rofecoxib)也在歐洲上市。這些COX-2抑制劑藥物成功上市， 為后續(xù)COX-2選擇性抑制劑的研究和發(fā)展開辟了廣闊道路。如 今在臨床上COX-2選擇性抑制劑已經(jīng)被廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牙痛、手術(shù)后疼痛以及腫瘤等疾病。

4、本試劑盒的檢測(cè)的基本原理參考圖1 。在輔助因子(Cofactor)存在的情況下，COX-2使用其環(huán)氧化酶(COX)活性把花生四烯酸 (Arachidonic Acid)等底物環(huán)氧化生成PGG2等中間產(chǎn)物，繼而COX-2使用其過氧化物酶(peroxidase)活性把PGG2等中間產(chǎn)物催 化生成PGH2等最終產(chǎn)物，同時(shí)把幾乎沒有熒光的COX-2探針(Probe)催化生成有強(qiáng)熒光的探針(Ex560/Em590)。這樣通過熒光 檢測(cè)就可以非常靈敏地檢測(cè)COX-2的酶活性。 如果在反應(yīng)中加入COX-2抑制劑(Inhibitor) ，熒光的生成就會(huì)被抑制，熒光強(qiáng) 度與抑制劑的抑制效果成反比，這樣就可以檢測(cè)出抑制劑的抑制效果。本反應(yīng)生成的強(qiáng)熒光探針的最大激發(fā)波長(zhǎng)為571nm， 最大發(fā)射波長(zhǎng)為585nm ，推薦檢測(cè)時(shí)的激發(fā)波長(zhǎng)為560nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。

圖1.  本試劑盒篩選COX-2抑制劑的原理圖。Probe*表示催化生成的強(qiáng)熒光探針

5、本試劑盒中提供了人重組COX-2(recombinant human COX-2, rhCOX-2)、底物(Substrate)、輔助因子(Cofactor)、陽(yáng)性對(duì)照COX-2 抑制劑(Celecoxib)及可以被COX-2催化產(chǎn)生熒光的熒光探針(Probe)，并且對(duì)COX-2和底物的使用量進(jìn)行了優(yōu)化。不僅能檢測(cè) 出IC50很低的抑制劑， 也能檢測(cè)出IC50較高的抑制劑。

6、用于96孔板檢測(cè)時(shí)， 一個(gè)包裝的本試劑盒可以進(jìn)行100次檢測(cè)。

保存條件：

-20ºC保存， 半年有效。S0168-2 COX-2 Probe和S0168-3 COX-2 Cofactor (50X)需避光保存。

注意事項(xiàng)：

1、 COX-2 Probe在空氣中不太穩(wěn)定，開啟后應(yīng)盡快使用， 且在使用過程中要注意適當(dāng)避光。

2、COX-2  Probe的反應(yīng)產(chǎn)物在還原劑的存在下會(huì)很不穩(wěn)定， 樣品中帶入到最終反應(yīng)體系中的二硫蘇糖醇(DTT)或者β-巰基乙醇 的濃度須低于10µM。

3、請(qǐng)確保樣品的pH值在7-8之間，或者確保加入樣品后反應(yīng)體系的pH值在7-8之間， 否則會(huì)影響COX-2 Probe的穩(wěn)定性和熒光值。

4、COX-2 Probe和COX-2 Assay Buffer需要完全解凍并回復(fù)至室溫后再使用， 否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。rhCOX-2使用時(shí)應(yīng)在冰上進(jìn) 行。 使用完畢后各試劑應(yīng)立即按照試劑盒要求的條件保存。

5、COX-2  Substrate容易被氧化，請(qǐng)盡量避免長(zhǎng)時(shí)間與空氣接觸。且在使用和儲(chǔ)存過程中請(qǐng)注意保持低溫，否則其穩(wěn)定性可能 會(huì)受到影響。

6、待測(cè)抑制劑的溶劑可能會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾，如無水乙醇和70%乙醇。推薦以COX-2 Assay Buffer 、Milli-Q級(jí)純水、 DMSO為 溶劑配制、稀釋待測(cè)抑制劑，并在對(duì)照孔中添加與抑制劑等體積的溶劑以排除干擾。

7、COX-2 Cofactor 、COX-2 Substrate 、rhCOX-2等試劑的量均比較少，在使用前請(qǐng)先適當(dāng)離心， 然后適當(dāng)混勻后再使用。

8、 Substrate Buffer有腐蝕性， 操作時(shí)請(qǐng)小心， 并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或腐蝕其他物品；Celecoxib對(duì)人體有害，操 作時(shí)請(qǐng)小心， 并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

9、本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

10、為了您的安全和健康， 請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：

1、樣品的準(zhǔn)備：

取適量待測(cè)定的抑制劑，用COX-2 Assay Buffer 、Milli-Q級(jí)純水、DMSO等適當(dāng)?shù)娜軇┡渲瞥蛇m宜濃度的溶液，如果有必要 可以配制成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻却�用�?注：抑制劑的稀釋和配制使用同一種溶劑通常會(huì)比較方便一些。

2、試劑盒的準(zhǔn)備：

A、融解除rhCOX-2以外的其它所有試劑至室溫，略離心使溶液沉淀至管底，再混勻備用。COX-2 Probe、COX-2 Cofactor (50X) 和COX-2 Substrate (50X)配制在DMSO中， 可37ºC水浴0.5-2min促進(jìn)融解。使用完畢后宜立即-20ºC避光保存。

B、 COX-2 Cofactor工作液的配制：按照每個(gè)樣品需要5微升COX-2 Cofactor工作液的比例配制適量的COX-2 Cofactor工作液。 取適量的COX-2 Cofactor (50X)，按照1:49的比例用COX-2 Assay Buffer稀釋。例如4微升COX-2 Cofactor (50X)加入196微 升COX-2 Assay Buffer配制成200微升COX-2 Cofactor工作液。配制好的COX-2 Cofactor工作液可4ºC存放， 僅限當(dāng)日使用。

C、COX-2工作液的配制：按照每個(gè)樣品需5微升COX-2工作液的比例配制適量的COX-2工作液。取適量的rhCOX-2  (25X) ， 按照1:24的比例用COX-2  Assay  Buffer稀釋。例如8微升rhCOX-2  (25X)加入192微升COX-2  Assay  Buffer配制成200微升 COX-2工作液。配制好的COX-2工作液可在冰浴上暫時(shí)保存，1小時(shí)內(nèi)酶活性基本穩(wěn)定。注： 所有涉及COX-2的操作應(yīng)在 冰上進(jìn)行。

D、COX-2 Substrate工作液的配制：按照每個(gè)樣品需5微升COX-2 Substrate工作液的比例配制適量的COX-2 Substrate工作液。 取適量的COX-2 Substrate (50X)，加入等體積的Substrate Buffer ，充分渦旋混勻，該混合物再按照1:24的比例用Milli-Q級(jí) 純水或重蒸水稀釋， 充分渦旋混勻。例如20微升COX-2 Substrate (50X)加入20微升Substrate Buffer，渦旋混勻后， 再加入 960微升Milli-Q級(jí)純水或重蒸水，再充分渦旋混勻，最終獲得1毫升COX-2 Substrate工作液。配制好的COX-2 Substrate工 作液可在冰浴上暫時(shí)保存， 1小時(shí)內(nèi)較為穩(wěn)定。注： COX-2 Substrate工作液也可在樣品檢測(cè)時(shí)37ºC孵育10分鐘的過程中配 制。

E、陽(yáng)性抑制劑Celecoxib溶液的配制： 本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照抑制劑Celecoxib濃度為100µM ，配制在DMSO中， 可以根據(jù) 需要使用與待測(cè)抑制劑一樣的溶劑稀釋成所需濃度或濃度梯度。通常Celecoxib的IC50約為10nM- 100nM ，使用本試劑盒 時(shí)Celecoxib的抑制效果參考圖2。

3、樣品檢測(cè)：

A、參考下表，使用96孔黑板設(shè)置對(duì)照孔和樣品孔， 并按照下表依次加入樣品和各溶液。加入待測(cè)樣品后， 混勻， 37ºC孵育 10分鐘。

注： 加入待測(cè)樣品后的孵育也可以在25ºC或室溫進(jìn)行。大多數(shù)的抑制劑對(duì)COX-2活性抑制具有時(shí)間依賴性，改 變與抑制劑的作用時(shí)間可以顯著改變化合物的IC50值， 建議通過測(cè)試確定未知抑制劑比較適合的孵育時(shí)間。為獲得更加可靠的檢測(cè)結(jié)果， 建議每個(gè)樣品至少應(yīng)該進(jìn)行2個(gè)重復(fù)孔的檢測(cè)。

 注： *樣品溶劑是指配制和稀釋待測(cè)抑制劑所用的溶劑。

B、各孔加入COX-2 Probe 5微升。

C、各孔快速加入COX-2 Substrate工作液5微升，混勻。 注： 加入COX-2 Substrate工作液后反應(yīng)即會(huì)開始， 如果孔數(shù)較多， 可以在低溫操作或使用排槍操作以減小各孔間加入COX-2 Substrate工作液的時(shí)間差而導(dǎo)致的誤差，混勻也可以在培養(yǎng)板振 蕩器上進(jìn)行。

D、37ºC避光孵育5分鐘后進(jìn)行熒光測(cè)定。激發(fā)波長(zhǎng)為560nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm 。當(dāng)熒光讀數(shù)偏低時(shí)，也可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí) 間至10-20分鐘。

4、計(jì)算:

A、計(jì)算每個(gè)樣品孔和空白對(duì)照孔的平均熒光值，可分別記錄為RFU空白對(duì)照 、RFU100%酶活性對(duì)照 、RFU陽(yáng)性抑制劑對(duì)照和RFU樣品 。RFU， Relative Fluorescence Unit。

B、計(jì)算每個(gè)樣品的抑制百分率。計(jì)算公式如下：

抑制率(%) = (RFU100%酶活性對(duì)照 - RFU樣品)/ (RFU100%酶活性對(duì)照 - RFU空白對(duì)照) × 100%

C、對(duì)于檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有效的制劑，通過檢測(cè)該抑制劑的劑量效應(yīng)就可以測(cè)定出該抑制劑的IC50 。本試劑盒檢測(cè)Celecoxib抑制 效果的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，IC50約為30nM。