產(chǎn)品及特點(diǎn)
本產(chǎn)品是動(dòng)物總 RNA 快速提取試劑動(dòng)物 RNAOUT（CAT#：3070）的柱式升級(jí)產(chǎn)品，可用于從各種動(dòng)物組織（包括白細(xì)胞）快速提取總 RNA。跟動(dòng)物 RNAOUT 相比其主要特點(diǎn)是：
1. 操作更加簡(jiǎn)單快速，整個(gè)過程只需要不到十分鐘（對(duì)一個(gè)樣品而言）。
2. RNA 純度更高，OD260/OD280 一般在 2.0 左右。
3. 一般不含用 RT-PCR 可以檢測(cè)到的基因組 DNA 污染。
4. 適用于培養(yǎng)細(xì)胞、大部分動(dòng)物組織和部分植物組織。
5. 得到的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern 雜交、cDNA 合成等實(shí)驗(yàn)
6. 性價(jià)比高于進(jìn)口的柱式 RNA 提取產(chǎn)品。
7. 可以進(jìn)行無氯仿操作，只是純度稍微降低，但不影響使用。
使用方法
下面的操作步驟是針對(duì)在 1.5 mL 塑料離心管中進(jìn)行的微量提取的，如果處理樣品量大，請(qǐng)按比例增加各成份的用量并使用大的離心管和離心機(jī)。
1. 根據(jù)組織細(xì)胞類型的不同分為下面及種情況使用：
a) 對(duì)貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，在每 10 平方厘米細(xì)胞中加入 1 mL 柱式動(dòng)物RNAout 溶液 A，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解并且讓基因組DNA 充分?jǐn)嗔选?/span>
b) 對(duì)懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，在每 1-5×106懸浮細(xì)胞中加入1 mL 柱式動(dòng)物 RNAout 溶液 A，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解并且讓基因組 DNA 充分?jǐn)嗔�。如果�?fibroblasts 或 carcinoma cell，1 mL 溶液 A 的細(xì)胞使用量不要超過 1×106個(gè)細(xì)胞。
c) 對(duì)新鮮組織：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入 10 mL 或15 mL 塑料離心管中，每 50-100 mg 組織加 1 mL 柱式動(dòng)物 RNAout溶液 A，用 Polytron 剪切式勻漿器勻漿 30 秒左右。對(duì)肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的 DNA），建議組織的使用量不要超過 50 mg/ mL 柱式動(dòng)物 RNAout 溶液 A，否則十分容易產(chǎn)生 DNA 污染。也可以用液氮研磨：在研缽中加入液氮，再加入 50-100mg新鮮組織，然后研磨粉后轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管中，再加入 1mL 柱式動(dòng)物 RNAout 溶液 A，震蕩 30 秒混勻。
d) 對(duì) RNALOCKER 保存組織：先用紙吸去 RNALOCKER 液體后再剪切成小塊，其余操作同新鮮組織的處理。
2. 如果進(jìn)行無氯仿操作（所得 RNA 純度稍低，但一般不影響后續(xù)使用），則將上步所得的細(xì)胞裂解物或勻漿液轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，12,000 rpm 室溫離心 3-5 分鐘。
3. 如果進(jìn)行帶氯仿操作（所得 RNA 純度比免氯仿操作稍高），則將上步所得的細(xì)胞裂解物或勻漿液轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，然后加入0.2倍體積的自備氯仿(1 mL柱式動(dòng)物RNAout溶液A需0.2 ml氯仿)，振蕩器充分振蕩混均 30 秒，12,000 rpm 室溫離心 3-5 分鐘。
4. 將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的 2 mL 塑料離心管中。注意：無氯仿操作時(shí)，離心后管底是細(xì)胞碎片和結(jié)締組織纖維。帶氯仿操作時(shí)，離心后分上下層，下層有機(jī)相和上下層中間含有 DNA 和蛋白質(zhì)，吸取上清時(shí)避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。為保險(xiǎn)起見，可以留下 100 uL 上清液不取。同時(shí)吸取上清時(shí)最好緩慢進(jìn)行。
5. 加入等體積的柱式動(dòng)物 RNAout 溶液 B，充分顛倒混勻。
6. 分次（一般需要 2-3 次）將加入柱式動(dòng)物 RNAout 溶液 B 后的混合液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12,000 rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。如果溶液粘稠，可以延長(zhǎng)離心時(shí)間到 2 分鐘。
7. 加 0.7 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，12,000 rpm 室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。一次洗滌一般足夠去除雜質(zhì)。
8. 再加 0.3 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，12,000 rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。此步可以省略。
9. 再室溫 12,000 rmp 干甩半分鐘。此步十分重要，否則殘留的通用洗柱液會(huì)影響 RNA 的使用。
10. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的 RNase-free1.5mL 塑料離心管中，加入50-100 uL RNA 洗脫液。
11. 室溫 12,000 rmp 離心半分鐘，離心管中溶液即為 RNA 樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
12. RNA 的電泳檢測(cè)：本試劑盒提取的 RNA 最好用甲醛變性膠電泳，如果在非變性的普通瓊脂糖膠（in TAE 或 TBE buffer）上電泳，一定要使用RNA 專用上樣液 RNAon（操作詳見 RNAon 使用手冊(cè)），千萬不要使用常用的 DNA 上樣液，因?yàn)?DNA 上樣液沒有經(jīng)過去 RNase 處理，也不能將 RNA 變性，得到的帶型將十分雜亂。
13. RNA 完整性的電泳檢測(cè)：如果需要做 Northern 雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行 RNA 電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。
14. RNA 產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定：將 5-10 μL RNA 溶于 TE 緩沖液中(pH7.5-8.2 之間)檢測(cè)其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度（1 OD260的 RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出 RNA 的產(chǎn)量（濃度 X 體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。
15. RNA 純度測(cè)定：無污染的總 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染，但一般不影響 RT-PCR 等反應(yīng)。
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