細(xì)胞培養(yǎng)步驟
a、細(xì)胞傳代：如果未超過80%匯合度時(shí)，將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中，留5ml完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)；如果細(xì)胞密度超80%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代具體步驟如下：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，使之完全脫落后吸出，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸。
4. 將細(xì)胞懸液按1：2的比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25瓶），補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
b、細(xì)胞凍存：
1、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心 5min；
3、 棄上清，沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號(hào)：C7001），混勻后加入凍存管中。
4、 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中，則需在-80℃冰箱 中存放24小時(shí)以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
C、細(xì)胞復(fù)蘇：
1、從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具），快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3、棄上清，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種至T25培養(yǎng)瓶，放于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4、第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
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