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胞漿異檸檬酸脫氫酶(ICDHc)試劑盒

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     意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

ICDHcEC 1.1.1.42)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,催化異檸檬酸脫氫脫羧生成 α-酮戊二酸,同時還原NADP+生成NADPHICDHc是細胞質中除了磷酸戊糖途徑外又一種NADPH重要來源,在逆境中該酶活性通常會發生顯著變化。


測定原理:

利用ICDHc催化NADP+還原成NADPH反應,在340 nm下測定NADPH濃度的增加。


所需的儀器和用品:

紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。


試劑的組成和配制:

提取液:60mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體50 mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1支,4保存;

試劑:粉劑×1支,4保存

試劑:粉劑×1支,-20保存;


樣本的前處理 

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液,超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g:提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。


測定步驟

1、 分光光度計預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2、 將試劑二轉移至試劑一中充分溶解,置于37(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴中預熱10min左右;用不完的試劑4℃保存。

3、 在試劑三中550μL蒸餾水充分溶解,置于37(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴中預熱10min左右用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

4、 在試劑四中550μL蒸餾水充分溶解,置于37(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴中預熱10min左右用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

5、 操作表:

試劑名稱μL

測定管

試劑一

750

試劑

10

試劑

10

樣本 

30

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,加樣本的同時開始計時;混勻,340nm波長下記錄20s時的初始吸光度A12min20s時的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1

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