注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
多胺氧化酶是催化生物體內多胺氧化的關鍵酶,通過調節體內多胺水平和生成物的濃度,參與各種植物體對逆境脅迫的反應和生長發育過程。
測定原理:
PAO催化多胺氧化產生過氧化氫,在過氧化氫酶存在的條件下與底物顯色,在550nm下有特征吸收峰,通過測定吸光值增加速率來反映PAO活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:液體6mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:液體3mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:液體3mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心20min,取上清,置冰上待測。
細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
血清等液體:直接測定。
測定步驟:
1、 分光光度計預熱30min以上,調節波長至550nm,蒸餾水調零。
2、 樣本測定
試劑名稱(µL) | 測定管 |
試劑一 | 700 |
試劑二 | 100 |
試劑三 | 50 |
樣本 | 100 |
試劑四 | 50 |
迅速混勻,于550nm下測定初始吸光值A1與30min后吸光值A2。ΔA=A2-A1。 |
PAO活性計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A550變化0.002為一個酶活力單位。
PAO(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.002÷T =166.67×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位定義:每g組織在每mL反應體系中每分鐘A550變化0.002為一個酶活力單位。
PAO(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.002÷T =166.67×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A550變化0.002為一個酶活力單位。
PAO(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.002÷T =0.333×ΔA
(4)按液體體積計算
單位的定義:每mL液體樣本在每mL反應體系中每分鐘A550變化0.002為一個酶活力單位。
PAO(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.002÷T =166.67×ΔA
V反總:反應體系總體積,1×10-3 L;V樣:加入樣本體積,0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。