注 意 ： 正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
HYP是機(jī)體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。
測(cè)定原理：
樣品經(jīng)酸水解產(chǎn)生游離的HYP，進(jìn)一步被氯胺T氧化，氧化產(chǎn)物與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，產(chǎn)生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰。通過(guò)測(cè)定樣品水解液560nm吸光值，可計(jì)算HYP含量。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、烘箱、玻璃管、離心機(jī)、水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 mL玻璃比色皿、無(wú)水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。
試劑組成和配制：
組織提取液：6mol/L鹽酸，自備。濃鹽酸：H2O（V/V）= 1:1，室溫保存。
細(xì)胞提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。
羥脯氨酸提取：
1. 組織：稱取約0.5g樣品于玻璃管，加入5mL的組織提取液，置于110℃烘箱，水解6至12小時(shí)，用提取液定容至5mL，12000g，25℃，離心20min，取上清待測(cè)。
2. 細(xì)胞：取500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，加入2mL的細(xì)胞提取液，于高壓消毒器中15磅保持30min，自然降壓后待測(cè)。
3. 血清游離羥脯氨酸提�。喝�0.2mL血清，加入1mL無(wú)水乙醇使蛋白質(zhì)沉淀，8000g4℃離心5min。將上清倒入另一個(gè)EP管，氮吹或沸水浴將乙醇揮發(fā)干。冷卻后再加入0.4mL50%異丙醇，充分溶解混勻待測(cè)。
測(cè)定操作表：
|
| 空白管 | 測(cè)定管 |
| 樣本（µL） |
| 200 |
| 試劑一（µL） | 200 | 200 |
| 混勻，室溫靜置20min | ||
| 試劑二（µL） | 200 | 200 |
| H2O（µL） | 600 | 400 |
| 混勻，60℃，20min，取出后25℃靜置15 min，蒸餾水調(diào)零，1mL玻璃比色皿中檢測(cè)560nm處吸光值。ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照 | ||
羥脯氨酸含量計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按組織計(jì)算
HYP含量（mg/g 鮮重）=（ΔA -0.0251）÷ 64.875×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.385×（ΔA -0.0251）÷W
（2）按細(xì)胞計(jì)算
HYP含量（mg/104 cell）=（ΔA -0.0251）÷ 64.875×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))
= 0.154×（ΔA -0.0251）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
（3）按液體體積計(jì)算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA -0.0251）÷ 64.875×V反總÷V樣×2
= 0.154×（ΔA -0.0251）
V反總：反應(yīng)總體積，1mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2mL；V樣總：加入提取液體積， mL； W：樣品質(zhì)量，g；2，血清吹干后復(fù)溶的倍數(shù)。
注意事項(xiàng)：
1、 OD值大于0.8，樣品適當(dāng)稀釋再測(cè)定，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)。
2、 試劑有一定的毒性，請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施，防止吸入或與皮膚接觸。
3、 最低檢出限為3.8mg/L。
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