I型膠原蛋白抗體免疫組化（IHC）試劑盒（抗兔）
Immunohistochemistry detection system kit (Rabbit)
產品貨號：IHC10423
產品規格：100T
產品描述：該試劑盒為客戶免疫組化檢測提供一站式解決方案，方便快捷。
本試劑盒用于檢測一抗（單克隆抗體或多克隆抗體）為兔源的免疫組化實驗。實驗原理為抗原與一抗形成抗原抗體復合物，生物素化二抗特異性結合上述復合物，經辣根酶標記的鏈酶卵白素特異性識別生物素，最后經辣根酶底物顯色即可檢測相應抗原。
保存條件：試劑盒中各試劑存儲條件不盡相同，收貨請打開包裝各自存放適當條件。
本試劑盒試劑0（一抗）及試劑 8,9（顯色液）請-20℃保存，避免反復凍融，密封一年有效。
試劑1及試劑10（蘇木素染液）室溫避光保存。
其他試劑請2-8℃避光封閉保存，密封一年有效。
各組分拆封打開后4℃保存一個月有效。
參考下表。
產品規格及組成成分：
| 試劑盒成分 | 100 Tests | 存儲 |
| 試劑 0：Collagen I | 50ul（1mg/ml） （IHC-P、IHC-F=1:100-500） | -20℃ |
| 試劑 1：1×PBS 緩沖液（干粉，2L） | 2L×4 袋 | 室溫 |
| 試劑 2：100×檸檬酸鈉抗原修復液 | 32ml | 2-8℃ |
| 試劑 3：內源性過氧化物酶阻斷劑（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 試劑 4：抗體稀釋液（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 試劑 5：封閉用正常山羊血清工作液（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 試劑 6：生物素標記羊抗兔 IgG（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 試劑 7：辣根酶標記鏈酶卵白素工作液（即用型） | 5ml | 2-8℃ |
| 試劑 8：DAB kit (20×)顯色液 | 0.5ml | -20℃ |
| 試劑 9：DAB kit (20×)稀釋液 | 0.5ml | -20℃ |
| 試劑 10：蘇木素染液（即用型） | 6ml | 室溫 |
| 說明書 | 1 份 | - |
樣本要求：新鮮活檢樣本組織，中性福爾馬林或多聚甲醛，固定時間 12-48h，參照病理技術規范要求取材、脫水、石蠟包埋并制成蠟塊，蠟塊在常溫條件下保存有效期有 5 年。組織切片厚度為 3-5μm 并黏
附在防脫玻片上，輕拍切片架并用吸水紙吸干組織切片中的水滴，再放入 56-60℃恒溫箱中烘烤 2h 后，從恒溫箱中移出玻片放在溫室下冷卻。如果切片在室溫下（15-28℃）保存，為了良好的重現組織中的抗原分布情況，請于切片制作后 7 天內完成檢測。
實驗操作步驟（以石蠟切片為例）
儀器、設備：
移液槍、免疫組化筆、水浴鍋、計時器、孵育濕盒、切片架、蓋玻片、光學顯微鏡、洗瓶等。
操作步驟
1.脫蠟水化。將石蠟切片置于新鮮二甲苯脫中浸泡 15 分鐘，重復三次。去除多余的液體后，依次置于無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡 5 分鐘，蒸餾水（或自來水）沖洗 5 分鐘。用 PBS 緩沖液（試劑 1，將干粉溶解于 2L 去離子水中）沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
2.抗原修復。將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯（或修復盒）中的耐高溫塑料切片架上，加適量修復液 1× 檸檬酸鈉抗原修復液（試劑 2，將 100×檸檬酸鈉抗原修復液加去離子水稀釋成 1×檸檬酸鈉抗原修復液），液面要浸過切片組織一定高度，將修復盒置于沸水中煮沸修復 15 分鐘后取出玻片，自然涼至室溫。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
注意：抗原修復時，修復液務必保證切片始終浸泡在液體內，一般情況：修復液的量約為 800mL/1 架。
3.阻斷內源性過氧化物酶。用吸水紙擦干玻片，免疫組化筆在組織周圍畫圈，滴加 50μL 內源性過氧化物酶阻斷劑（試劑 3）到切片組織上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育 30 分鐘，用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
4.血清封閉。用吸水紙擦干玻片，滴加 50μL 正常山羊血清工作液（試劑 5），37℃封閉 20 分鐘，以減少非
特異性染色。
5.一抗孵育。用抗體稀釋液（試劑 4）將一抗原液稀釋成工作液，用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體，滴加適量抗體工作液，置于濕盒 4℃孵育過夜或 37℃孵育 1h-2h。
6.復溫。4℃過夜后從冰箱拿出樣本，在室溫下孵育 15min 復溫（抗體孵育為 4℃過夜選用此步驟，如室溫孵育直接進入下一步清洗）。用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
7.二抗孵育。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 生物素標記的羊抗兔 IgG（試劑 6），37℃孵育 20 分鐘，用 PBS
緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
8.三抗孵育。吸水紙擦干切片后滴加 50μL 辣根酶標記的鏈酶卵白素孵育（試劑 7），37℃孵育 20 分鐘，用 PBS 緩沖液沖洗切片 5 分鐘，重復三次。
9. 顯色。甩去 PBS 緩沖液，吸水紙擦干切片； 每張切片滴加新鮮配制的 DAB 工作液 50 μL
（試劑 8：試劑 9：試劑 1=1:1:18 比例配置），孵育 3-5min，光學顯微鏡下觀察染色結果，切勿顯色過深；顯色后用自來水沖洗切片終止顯色。
10.復染。滴加適量蘇木素染液（試劑 10）復染，孵育 1-5 分鐘，自來水沖洗 5 分鐘，滴加鹽酸酒精分化液分化 30 秒，自來水沖洗。
11.脫水封片。將玻片依次置于 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇，各浸泡 5 分鐘， 再將玻片放入二甲苯中浸泡 15 分鐘，重復三次。玻片取出來稍晾干，用中性樹膠封片。
結果判斷
在光學顯微鏡下對染色的切片觀察并判斷。蘇木素染細胞核為藍色，DAB 顯色的陽性表達為棕黃色。
冰凍切片的免疫組化染色步驟
- 速凍組織
- 冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內，或進行短暫預固定后儲存于-20℃冰箱
- 室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，也可根據需要選擇其他的固定方式
- PBS沖洗，5分鐘×3次
- 用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性
- PBS沖洗，5分鐘×3次
- 下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）
注意事項
1. 檢測樣本時需同時做陰性對照和陽性對照，否則結果不可取。
2. 本品中的配套試劑，請不要用其他生產商產品替換使用。
3. DAB 為致癌物質，請采取必要的防范措施，現用現配。
4. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療。
5. 此試劑是否可用于除中性福爾馬林或多聚甲醛之外固定的組織未得到驗證。
如需其他相關輔助試劑，可咨詢客服購買
