Bsu DNA聚合酶是具有鏈置換活性的DNA恒溫擴增聚合酶,主要應(yīng)用于RPA重組酶擴增。重組酶UvsX與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物,能在雙鏈DNA中尋找同源序列;一旦引物定位了同源序列,就會發(fā)生鏈交換反應(yīng),Bsu DNA聚合酶啟動DNA合成,對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合,防止進一步替換。 本Bsu DNA 聚合酶來源于 嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus subtilis),系將Bacillus subtilis DNA 聚合酶(Bsu) I 基因的前296個AA截去而得。該酶保留了Bsu I 的 5´-3´ 聚合酶活性,但是缺失了 5´-3´ 核酸外切酶結(jié)構(gòu)域,該酶自身缺失 3´-5´ 核酸外切酶活性,可用于重組酶擴增。 | ||
應(yīng)用 | ||
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活性定義 | ||
在37℃條件下,30min內(nèi)參入10nmol酸性不容物定義為1個活性單位。 | ||
性能測試 | ||
按照如下體系配制反應(yīng): Plasmid DNA 100 ng 10×Bsu Reaction Buffer 5 μl Random9 (100μM) 2 μl dNTP mixture(10 mM) 2 μl Rnase free H2O upto 50 μl 混勻后95℃ 5min,然后冰上放置5min,分別加入不同劑量Bsu DNA聚合酶(泳道1-2:0, 泳道3-4:0.5 μl, 泳道5-6:1 μl,泳道7-8:2 μl,泳道9-10:4 μl,),分別在25℃和37℃孵育3h,電泳檢測各組產(chǎn)物如下圖 | ||
1X Bsu Reaction Buffer | ||
50 mM NaCl ,10 mM Tris-HCl (Ph7.5) , 10 mM MgCl2 , 1 mM DTT | ||
儲存 | ||
-20℃可保存2年,避免反復(fù)凍融。 | ||
熱失活 | ||
75°C,20min。 | ||
注意事項 | ||
1、由于缺乏3 ´-5 ´核酸外切酶活性,Bsu DNA 聚合酶不能切除 3´未配對的突出末端,因而不適用于生成平齊末端。 2、25℃ 時 Bsu DNA 聚合酶 保留 50% 的活性,是同溫度下 Klenow 片段(3´-5´ exo-)的兩倍。 |
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