Gibson無縫連接試劑盒

產品類別：科研試劑
產品編號：D2601
存儲條件：-20℃
保質期：2年

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10T

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50T

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Gibson無縫連接試劑盒是一種混合酶系統，其可將任意方法線性化的載體和與其兩端具有重疊區域的一個或多個PCR片段定向重組連接。該方法不依賴于T4 DNA連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，可在30分鐘內實現PCR片段高效定向無縫克隆至載體的任意位置，從而獲得完整的雙鏈DNA分子。該試劑盒使用簡單，只需加入合適比例的載體和PCR片段在室溫孵育15-30min即可完成片段的連接。

優勢

室溫孵育即可完成片段的連接,無需50℃。
不受載體或插入片段酶切位點限制在任意位置進行無縫克隆
不依賴于T4連接酶，高效連接，無堿基缺失
可同時高效連接一個或多個PCR片段
無需額外的亞克隆，菌檢陽性率高達95%

原理

T5外切酶可從雙鏈DNA5'端切割形成3'突出末端，從而促進重疊區域的具有互補序列的片段進行退火。
高保真DNA聚合酶可使退火的片段向3'端延伸，從而填補片段缺口。
Taq DNA連接酶可封閉缺刻從而獲得完整的雙鏈DNA分子。

組分

組分名稱	10T	50T
2XGibson Assemble Mix	50μl	250μl

儲存

-20℃可保存2年，-80℃可保存5年，避免反復凍融。

檢測效果和應用實例

(1). KpnI/HindIII酶切pCold-sumo-M vector獲得線性化載體，插入與載體有25nt同源臂的引物擴增Gp32基因（966bp），然后應用2xGiboson Assembly Mix連接線性化載體和Gp32，室溫孵育15min，然后取5μl連接產物轉化DH5a感受態細胞，涂板過夜后菌檢。其中左圖為長斑情況對比，A為對照（不加片段）B為實驗組（Gp32片段），右圖為挑取32個斑進行PCR擴增后電泳，其中陽性檢出率為31/32(~97%)。

(2).PCR 擴增pCold-sumo-M vector獲得線性化載體，插入與載體有15nt同源臂的引物擴增Bsu基因（1.4kb），然后應用2xGiboson Assembly Mix連接線性化載體和Bst，室溫孵育30min，然后取5μl連接產物轉化DH5a感受態細胞，涂板過夜后菌檢。其中左圖為長斑情況對比，A為對照（不加片段）B為實驗組（Bsu片段），右圖為挑取40個斑進行PCR擴增后電泳，其中陽性檢出率為40/40(~100%)。

(3).以單片段連接為例，載體與片段不同摩爾比對連接效率的影響。載體2742bp，片段2439bp，使用載體與片段摩爾比分別為2:1;1:1;1:2;1:3;1:4;1:5 室溫連接30min；片段5’和3’端與載體同源序列大小都為17bp，使用通用引物菌檢，陽性條帶應為2598bp。結果表明：載體與連接片段選用不同摩爾比對于菌斑數和菌檢陽性率的影響較大，綜合推薦摩爾比1:5。圖中1-6代表載體與片段摩爾比分別為2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。

(4).以單片段連接為例，不同的載體量對連接效率的影響。載體2742bp，片段2439bp，使用載體與片段摩爾比為1:5，載體用量分別為0.001pmol、0.005pmol、0.01pmol和0.015pmol室溫連接30min；片段5’和3’端與載體同源序列大小都為17bp，使用通用引物菌檢，陽性條帶應為2598bp。結果表明：載體用量在0.01~0.015pmol之間，菌斑數和菌檢陽性率較高。圖中1-4分別代表載體用量為0.001pmol、0.005pmol、0.01pmol和0.015pmol。

(5).多片段連接
單片段連接：載體長2742bp，片段1長2439bp，使用載體與片段摩爾比為1:5，載體用0.01pmol，室溫連接30min，片段5’和3’端與載體同源序列大小都為17bp，使用通用引物菌檢，陽性條帶應為2598bp。
雙片段連接：片段2長654bp，片段3長1802bp，載體長2742bp，載體與片段摩爾比為1:5（片段2和3皆為0.05pmol），載體用0.01pmol，室溫連接30min，各片段之間的同源序列長度皆為17bp，通用引物菌檢陽性條帶為2598bp。
三片段連接：片段2長654bp，片段4長822bp，片段5長997bp，載體長2742bp，載體與片段摩爾比為1:5（片段2、4和5皆為0.05pmol），載體用0.01pmol，室溫連接30min，各片段之間的同源序列長度皆為17bp，通用引物菌檢陽性條帶為2598bp。
圖中1-3分別為單片段、雙片段和三片段連接，A-E為PCR擴增連接所需片段，分別為片段2：654bp，片段1：2439bp，片段3：1802bp，片段5：997bp，片段4：822bp，結果表明：單片段連接的效率顯著高于雙片段和三片段連接，在進行雙片段和三片段連接時，陽性菌檢率在50%左右，可多挑取菌斑進行菌檢。