| 熱敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是來源于嗜冷海洋細(xì)菌經(jīng)大腸桿菌表達(dá)純化的的重組蛋白，又稱南極熱敏UDG。該熱敏UDG酶能有效地水解單鏈或雙鏈 DNA 上的尿嘧啶，產(chǎn)生的缺嘧啶位點(diǎn)，在高溫或高 pH 下，極易水解斷裂。該酶對RNA無活性，主要用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的防污染。大腸桿菌來源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶較為耐熱，經(jīng)95℃10min處理仍會(huì)殘留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，導(dǎo)致含有dU堿基的PCR產(chǎn)物的降解。而來源于嗜冷海洋細(xì)菌的熱敏UDG在50℃ 5min即完全失活，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性），25℃10min即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染，由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性）在PCR循環(huán)的94℃變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響新的含dU的PCR產(chǎn)物。 | ||||||||||||||||||||||||||
組分 | ||||||||||||||||||||||||||
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應(yīng)用 | ||||||||||||||||||||||||||
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活性定義 | ||||||||||||||||||||||||||
| 在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下，37°C每分鐘催化 60 pmol 尿嘧啶從含尿嘧啶的雙鏈 DNA 上釋放所需要的酶量為一個(gè)活性單位。 | ||||||||||||||||||||||||||
反應(yīng)buffer | ||||||||||||||||||||||||||
| Heatlabile Uracil DNA Glycosylase (UDG)與絕大多數(shù)的PCR 聚合酶反應(yīng)緩沖液都是兼容的，但在高離子濃度(>100mM)下活性會(huì)受到抑制。 | ||||||||||||||||||||||||||
酶保存液 | ||||||||||||||||||||||||||
| 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。 | ||||||||||||||||||||||||||
儲(chǔ)存 | ||||||||||||||||||||||||||
| -20℃可保存2年，避免反復(fù)凍融。 | ||||||||||||||||||||||||||
熱失活 | ||||||||||||||||||||||||||
| 50℃，10min。 | ||||||||||||||||||||||||||
實(shí)例 | ||||||||||||||||||||||||||
| 為評(píng)估熱敏UDG對殘留模板去除的能力，我們首先使用含dUTP的RAPA3G Probe qPCR MasterMix擴(kuò)增三種基因產(chǎn)物（GAPDH,EHP,Covid-19 N Gene），然后以105拷貝的含U產(chǎn)物作為模板，分別加入0.1U/reaction、0.25U/reaction、0.5U/reaction和1U/reaction 的熱敏UDG(C5029)進(jìn)行qPCR，程序如下： 25℃ 2min, 95℃ 5min 95℃ 5s 60℃ 30s 45cycles 25℃孵育2min使UDG發(fā)揮活性，降解含U產(chǎn)物，以降低其產(chǎn)生假陽性信號(hào)的機(jī)會(huì)；統(tǒng)計(jì)三組加熱敏UDG和不加UDG組反應(yīng)的Ct值（如下表），得到△Ct，△Ct值越大說明去除殘留產(chǎn)物的效率越高。本實(shí)驗(yàn)說明：0.1U/反應(yīng)的該熱敏UDG即可很好的降解含U產(chǎn)物（如下圖），即具有良好的去除殘留模板的能力。 | ||||||||||||||||||||||||||
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