組織活性氧(ROS)檢測試劑盒（DHE）

一、產品簡介：

組織活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DHE進行組織活性氧檢測的試劑盒。本試劑盒中的DHE ROS探針為紅色熒光的活性氧探針，具有510/610nm的最大激發/發射波長。DHE ROS探針在組織中活性氧存在的條件下，被氧化生成紅色熒光物質，紅色熒光強度與組織內活性氧水平成正比，檢測 DHE 產物的熒光強度就可以知道組織內活性氧的水平。 在激發波長510nm，發射波長610nm附近，使用熒光分光光度計、熒光酶標儀、等檢測DHE產物熒光，從而測定組織內活性氧水平。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括過氧化氫（H2O2，Hydrogen peroxide）、羥基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、單線態氧（1O2，Singlet oxygen）、 一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧陰離子(•O2-，Superoxide anion)、過氧化自由基(ROO•，Peroxylradical)、過氧羥自由基（HOO•，hydroperoxyl）及其下游產物過氧化物過氧亞硝基陰離子
（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羥化物等，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。
  活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生主要是氧化磷酸化的結果，在呼吸鏈中，在某些位點會有“泄露”的電子直接和氧氣或和其他電子受體反應，在酶或非酶作用下引發 一系列反應生成不同種類的活性氧：“泄露”的電子最初和氧氣反應生成超氧陰離子自由基（O2•-）。超氧陰離子遇水生成 H2O2，同時過氧化氫也可由氧氣在單 胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）的作用下生成，生成的過氧化氫在髓過氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）的催化下與 Cl-反應可生成ClO-，在鐵或銅離子的催化下發生Fenton反應生成OH•，超氧陰離子遇氮氧化物反應生成ONOO-。這些生成的高氧化活性的物質統稱為活性氧。
  適用：新鮮組織， 一般最好使用新鮮組織樣本檢測活性氧，反映的是組織當時的活性氧狀態。凍存的組織樣本的ROS在長期凍存過程中會損失掉，有條件的話就使用新鮮樣本，不建議使用凍存的組織樣本。已經凍存的組織樣本中殘余的ROS也可以用本試劑盒檢測。

二、產品組成：

三、自備材料：

1、熒光分光光度計或熒光酶標儀(激發波長488-535nm，發射波長610nm)

離心機，移液器，冰箱，冰盒

2、PBS 緩沖液（10mM,PH7.4 ）或者 HBSS

3、離心管，吸頭，一次性手套，熒光檢測專用黑色 96孔板

四、使用注意事項:

1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

2、DHE染色液為 DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

3、使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進行簡短離心使 DMSO溶液集中于管底。

4、盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。

五、樣本處理： 

1、剛取得的新鮮組織樣本用pbs洗凈.

2、準確稱取50mg組織，加入1ml勻漿緩沖液A，用玻璃勻漿器充分勻漿。

3、在100xg，4℃離心3分鐘，棄沉淀，取上清。

六、樣本檢測:

1、在96孔板中加入200微升勻漿上清液、2微升DHE 探針，用移液器吹打，使之充分混勻。

【注意】:

①不同樣本的活性氧差異較大，需要根據預實驗結果調整探針用量。一般加入2ul探針，染色終濃度按試劑盒中探針母液的100-2000倍稀釋，200-1000倍稀釋適合大多數樣本。最大稀釋比例可至2000倍。

②如果熒光強度太強，超過了檢測儀器的量程，可以減少探針用量。保證所有樣本探針用量一致即可。

③以酶標儀檢測為例。也可以用熒光分光光度計檢測，根據所使用儀器決定勻漿液體積和染色容器。

④染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

⑤微量操作時，注意探針要有效加入勻漿液，避免沒有加入。

2、在37℃避光孵育15-30分鐘。

3、置于熒光酶標儀中，后于激發波長為488-535 nm、發射波長610 nm檢測熒光強度。

【注意】

①或使用熒光光度計等其它熒光檢測設備。

②必須使用熒光檢測專用的黑色96孔板。

③如果熒光強度太強，超過了儀器的檢測范圍，可以將孵育后的勻漿上清液稀釋后再檢測。一般稀釋5-50倍。

七、蛋白定量:

1. 另取50微升上清勻漿液，用PBS大約稀釋30倍。

2. 取100微升進行蛋白定量。

八、結果處理:

以熒光強度（RFU)/蛋白濃度（毫克蛋白）表示組織活性氧強度。

【注意】:

①數據與蛋白濃度的單位無關。

②此處以蛋白濃度數據作為校正系數，對不同樣品進行均一化處理。

③熒光強度強則活性氧（ROS）含量高。

④可以用實驗中對照樣本的熒光強度值為基準，待測組樣本的熒光強度值占對照樣本的百分比來比較活性氧（ROS）程度差異。

九、常見問題分析：

①活性氧結果如何分析?

ROS是多種物質的統稱，不像某一單一活性氧指標，無法檢測其絕對的含量，只能通過設置參照樣本，以參照樣本的倍數來反映目標樣本相對含量變化，這個“相對”是針對參照的。分析結果是定性的，也是沒有單位的，因為它本質上是一個比值（目標/參照)。反映的是模型樣本通過具體的干預措施（如養分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等）如何影響其ROS的變化，測定其ROS是增加或者降低了。

②熒光強度在變化?

可以觀察到熒光的逐漸增加（由于自動氧化）或減少（由于細胞中的染料損失或光漂白)。在沒有任何刺激或誘導的情況下，健康的未經處理的樣本中的熒光突發可以指示細胞死亡或一些其他氧化事件的進展。

注意檢測時平行操作即可。

十、存儲：2-8℃保存

如果長期不用，勻漿液2-8℃保存，探針-20℃避光保存

十一、有效期：未拆封一年，拆封請盡快使用完

文獻參考：