保存溫度
2-8℃ 避光
注意事項(xiàng)
1.探針-20℃密封避光保存；
2.避免反復(fù)凍融。
3.注意防止氧化；
4.試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！
2.避免反復(fù)凍融。
3.注意防止氧化；
4.試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！
有效期
6個(gè)月
檢測(cè)方法
熒光酶標(biāo)儀
適用樣本
細(xì)胞，分離的線粒體等
產(chǎn)品特點(diǎn)
1.廣泛適用于各種體外模型；不再局限于單層細(xì)胞，還能測(cè)定懸浮細(xì)胞、微生物和特定的 3D 培養(yǎng)物；
2.簡(jiǎn)單的“混合-檢測(cè)”方案允許使用多種其他分析試劑盒進(jìn)行多參數(shù)分析；
3.可逆轉(zhuǎn)，能夠觀察耗氧量的瞬態(tài)和長時(shí)間變化；
4.可適配多數(shù)熒光酶標(biāo)儀以及標(biāo)準(zhǔn) 96 孔和 384 孔；
5.以高通量的形式方便地測(cè)量；
6.無需等待專用設(shè)備空閑所需的實(shí)驗(yàn)室時(shí)間，也無需大額資金專用設(shè)備投入。
2.簡(jiǎn)單的“混合-檢測(cè)”方案允許使用多種其他分析試劑盒進(jìn)行多參數(shù)分析；
3.可逆轉(zhuǎn)，能夠觀察耗氧量的瞬態(tài)和長時(shí)間變化；
4.可適配多數(shù)熒光酶標(biāo)儀以及標(biāo)準(zhǔn) 96 孔和 384 孔；
5.以高通量的形式方便地測(cè)量；
6.無需等待專用設(shè)備空閑所需的實(shí)驗(yàn)室時(shí)間，也無需大額資金專用設(shè)備投入。
產(chǎn)品應(yīng)用
線粒體功能和細(xì)胞代謝研究
儀器準(zhǔn)備
1.熒光酶標(biāo)儀
須配備相應(yīng)的波長過濾器和溫度控制器。
2.離心機(jī)
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
須配備相應(yīng)的波長過濾器和溫度控制器。
2.離心機(jī)
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
試劑準(zhǔn)備
PBS緩沖液或者HBSS
耗材準(zhǔn)備
1.黑色透明底熒光專用96孔培養(yǎng)板
2.離心管
3.吸頭
4.一次性手套
2.離心管
3.吸頭
4.一次性手套
使用注意事項(xiàng)
1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。
2.細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。
3.以下操作以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例。其他培養(yǎng)容器或裝置請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整試劑用量和檢測(cè)方法。各試劑等比例調(diào)整即可。O2熒光探針終濃度25倍稀釋最佳。
4. R01探針的信號(hào)變化直接取決于所測(cè)量細(xì)胞類型的細(xì)胞呼吸速率，建議盡可能使用每孔高的細(xì)胞密度作為起點(diǎn)，并根據(jù)需要減少細(xì)胞數(shù)量。
5.并非所有細(xì)胞類型都消耗足夠用于檢測(cè)的氧氣。
6.必須使用熒光培養(yǎng)專用的透明底黑色培養(yǎng)板，減少檢測(cè)時(shí)各孔之間的光互相干擾。
7.用于測(cè)定的所有儀器試劑溶液耗材均需37℃預(yù)熱。
8.添加氧氣封閉液時(shí)注意避免產(chǎn)生氣泡。
9.盡可能使用多通道移液器添加試劑。
10.如果藥物有紅色熒光（如阿霉素等）需要換液，不含培養(yǎng)基和待測(cè)藥物，用HBSS或PBS體系檢測(cè)，在無血清無酚紅環(huán)境檢測(cè)。
11.建議設(shè)定FCCP處理的陽性對(duì)照樣本。
2.細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。
3.以下操作以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例。其他培養(yǎng)容器或裝置請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整試劑用量和檢測(cè)方法。各試劑等比例調(diào)整即可。O2熒光探針終濃度25倍稀釋最佳。
4. R01探針的信號(hào)變化直接取決于所測(cè)量細(xì)胞類型的細(xì)胞呼吸速率，建議盡可能使用每孔高的細(xì)胞密度作為起點(diǎn)，并根據(jù)需要減少細(xì)胞數(shù)量。
5.并非所有細(xì)胞類型都消耗足夠用于檢測(cè)的氧氣。
6.必須使用熒光培養(yǎng)專用的透明底黑色培養(yǎng)板，減少檢測(cè)時(shí)各孔之間的光互相干擾。
7.用于測(cè)定的所有儀器試劑溶液耗材均需37℃預(yù)熱。
8.添加氧氣封閉液時(shí)注意避免產(chǎn)生氣泡。
9.盡可能使用多通道移液器添加試劑。
10.如果藥物有紅色熒光（如阿霉素等）需要換液，不含培養(yǎng)基和待測(cè)藥物，用HBSS或PBS體系檢測(cè)，在無血清無酚紅環(huán)境檢測(cè)。
11.建議設(shè)定FCCP處理的陽性對(duì)照樣本。
使用方法
關(guān)于儀器設(shè)置：
溫度對(duì)檢測(cè)有較大影響。有條件的話，務(wù)必使用配有溫度控制的酶標(biāo)儀。
常規(guī)的熒光信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量，使用基于單色儀或基于過濾器的酶標(biāo)儀，最佳激發(fā)波長使用450-460 nm，發(fā)射波長使用586-600 nm�？筛鶕�(jù)實(shí)際機(jī)器和樣本選擇信號(hào)最強(qiáng)的波長。
具有檢測(cè)增益參數(shù)（PMT，Parameters）的通常設(shè)置為中或高。
使用bottom read讀數(shù)和top read讀數(shù)均可，基于不同的細(xì)胞模型，建議在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)兩種讀數(shù)模式均嘗試下，看哪種的趨勢(shì)更加明顯。
關(guān)于氧氣封閉液使用：
氧氣封閉液可以用移液器吸取添加，添加時(shí)需要沿著培養(yǎng)板壁慢慢加入，使其順板壁向下流到培養(yǎng)基表面。
也可以直接用滴瓶滴加，倒轉(zhuǎn)預(yù)熱的滴管瓶并輕輕施加壓力，使封閉液足以充注瓶尖。 每個(gè)孔滴兩滴，使每個(gè)液滴在孔側(cè)面順應(yīng)向下流到培養(yǎng)基表面。
使用移液器添加封閉液時(shí)，可將黃色吸頭的嘴部用鋒利的刀片或剪刀修剪處理。將豎直吸頭離尖端3-4 mm處45°角修剪處理。
取下滴管瓶?jī)?nèi)嘴蓋，輕輕吸取預(yù)熱的氧氣封閉液。避免上下吹吸形成氣泡。
關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)：
對(duì)于貼壁細(xì)胞，在200 μL培養(yǎng)基中的96孔板中接種細(xì)胞。在37°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。
對(duì)于懸浮細(xì)胞，在檢測(cè)當(dāng)天在100 μL培養(yǎng)基中接種。
注意所需的接種密度取決于細(xì)胞類型。 我們推薦進(jìn)行細(xì)胞接種密度預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳密度。通常從高細(xì)胞密度（通常為60,000）開始，每孔的最佳細(xì)胞數(shù)一般為：貼壁細(xì)胞每孔80,000個(gè)細(xì)胞，懸浮細(xì)胞每孔5-6 x 105（96孔板）。
檢測(cè)待測(cè)樣品都設(shè)置3復(fù)孔。
注意始終在每個(gè)96孔板上留出至少6個(gè)孔，以免添加細(xì)胞作為空白對(duì)照和信號(hào)控制孔。
1. 準(zhǔn)備細(xì)胞模型。
2. 培養(yǎng)好的待檢測(cè)細(xì)胞移除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞。
3. 加入100 μL新鮮培養(yǎng)基。
4. 加入4 μL R01氧熒光探針，充分混勻。
5. （可選）可以在此處添加待測(cè)試化合物（通常為1-10μL）（如果需要的話）。
6. 每孔加入100 μL氧氣封閉液。
7. 然后用該細(xì)胞板進(jìn)行熒光細(xì)胞外O2消耗變化情況檢測(cè)。
激發(fā)波長455 nm - 468 nm，發(fā)射波長603 nm。測(cè)定熒光強(qiáng)度，每2分鐘或3分鐘讀取一次。
8. 繪制耗氧率曲線。
9. 計(jì)算每個(gè)樣品的斜率值。
常見問題分析
1.耗氧率檢測(cè)趨勢(shì)跟預(yù)期的不一致？
可以從以下方面改善：
檢查細(xì)胞接種和移液的一致性。
增加細(xì)胞密度。
將測(cè)定體積減少到60微升。
在某些較短的檢測(cè)時(shí)間區(qū)間內(nèi)，會(huì)出現(xiàn)熒光數(shù)據(jù)的波動(dòng)情況，出現(xiàn)斜率下降或不變化，需要擴(kuò)大到更長的時(shí)間范圍內(nèi)來分析耗氧率趨勢(shì)。一般檢測(cè)時(shí)間范圍不少于30分鐘。
溫度對(duì)檢測(cè)有較大影響。有條件的話，務(wù)必使用配有溫度控制的酶標(biāo)儀，儀器以及所有培養(yǎng)基和儲(chǔ)備溶液均須使用前37℃預(yù)熱。注意某些讀板器的溫度控制不一致，如果存在這種情況，請(qǐng)考慮將測(cè)定和平衡溫度降低到30℃，避開外圈。
2.使用的細(xì)胞類型靈敏度不夠？
可以考慮以下改善方案：
增加酶標(biāo)儀的增益（PMT）設(shè)置。
在無酚紅或無血清的情況下測(cè)定。
增加 R01氧熒光探針的體積（至10 μL/孔）。
減少 R01氧熒光探針的體積（至2 μL/孔）。
增加細(xì)胞密度。
將測(cè)定體積減少到60微升。
測(cè)量底部讀數(shù)（如果有）。
調(diào)整焦距。
可以從以下方面改善：
檢查細(xì)胞接種和移液的一致性。
增加細(xì)胞密度。
將測(cè)定體積減少到60微升。
在某些較短的檢測(cè)時(shí)間區(qū)間內(nèi)，會(huì)出現(xiàn)熒光數(shù)據(jù)的波動(dòng)情況，出現(xiàn)斜率下降或不變化，需要擴(kuò)大到更長的時(shí)間范圍內(nèi)來分析耗氧率趨勢(shì)。一般檢測(cè)時(shí)間范圍不少于30分鐘。
溫度對(duì)檢測(cè)有較大影響。有條件的話，務(wù)必使用配有溫度控制的酶標(biāo)儀，儀器以及所有培養(yǎng)基和儲(chǔ)備溶液均須使用前37℃預(yù)熱。注意某些讀板器的溫度控制不一致，如果存在這種情況，請(qǐng)考慮將測(cè)定和平衡溫度降低到30℃，避開外圈。
2.使用的細(xì)胞類型靈敏度不夠？
可以考慮以下改善方案：
增加酶標(biāo)儀的增益（PMT）設(shè)置。
在無酚紅或無血清的情況下測(cè)定。
增加 R01氧熒光探針的體積（至10 μL/孔）。
減少 R01氧熒光探針的體積（至2 μL/孔）。
增加細(xì)胞密度。
將測(cè)定體積減少到60微升。
測(cè)量底部讀數(shù)（如果有）。
調(diào)整焦距。
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