血管性血友病因子（vWF）是一種參與止血的血液糖蛋白，特別是血小板粘 附。它在Von Willebrand 病中缺乏和/或有缺陷，并參與許多其他疾病，包括血栓性血小板減少性紫癜、海德氏綜合征，以及可能的溶血性尿毒癥。vWF 也是一種存在于血漿中的大型多聚體糖蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞（在 Weibel-Palade 體內(nèi)）、巨核細(xì)胞（血小板的α顆粒）和內(nèi)皮下結(jié)締組織中組成性地產(chǎn)生超大型 vWF。基本的vWF 單體是一個(gè) 2050 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。每個(gè)單體都包含一些具有特定功能的結(jié)構(gòu)域。它的多聚體可以非常大，>20,000kDa，并由80多個(gè)亞單位組成，每個(gè)亞單位250kDa。

本試劑盒人VWF免疫測(cè)定是一種兩步法90分鐘固相ELISA，用于測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的人VWF。試劑盒包含大腸桿菌表達(dá)重組人VWF和針對(duì)重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然人VWF獲得的結(jié)果顯示出與使用重組標(biāo)準(zhǔn)品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線平行的線性曲線。這些結(jié)果表明，該試劑盒可用于測(cè)定天然人VWF的相對(duì)質(zhì)量值。

檢測(cè)原理 

試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將人血管性血友病因子(VWF)捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的VWF，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗Human-VWF抗體，與VWF結(jié)合形成“抗體-抗原-抗體-HRP”免疫復(fù)合物，加入TMB顯色后，若樣本中有VWF則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測(cè)過(guò)程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)OD值，顏色的深淺和樣品中的人血管性血友病因子(VWF)的含量呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中VWF的濃度。

檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的局限性

僅供科研使用，不能用于臨床診斷或治療。

試劑盒的使用期限不得超過(guò)試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來(lái)源的試劑混合使用或替換使用。

如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測(cè)定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測(cè)定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時(shí)間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。

樣本采集、處理和存儲(chǔ)的變化可能會(huì)導(dǎo)致樣本值的差異。

本試劑盒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除了不同生物樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。

操作要點(diǎn) 

混合蛋白質(zhì)溶液時(shí)，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時(shí)應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨(dú)使用容器。

確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。

當(dāng)使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測(cè)定精度。

顯色劑應(yīng)保持無(wú)色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色。

應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。

需要的其他材料

l 酶標(biāo)儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時(shí)包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；

l 移液器及槍頭；

l 蒸餾水或去離子水

l 100-1000 mL刻度量筒。

l 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)。

l 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。

l 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。

注意事項(xiàng)

此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。

該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會(huì)引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

顯色劑B可能會(huì)引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。

樣品預(yù)處理

下面列出的樣品收集和儲(chǔ)存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評(píng)估。

細(xì)胞培養(yǎng)上清液：以1000×g離心20分鐘，去除顆粒，立即進(jìn)行測(cè)定或等分裝樣品，并將樣品儲(chǔ)存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品建議10倍稀釋。例如：20μL樣品+180μL的1×稀釋液）

血清：使用血清分離管，使樣品在室溫下凝結(jié)30分鐘，然后在1000×g下離心15分鐘。立即取出血清并進(jìn)行測(cè)定或等分裝樣品，將樣品儲(chǔ)存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血清樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）

血漿：使用EDTA或肝素作為抗凝劑收集血漿。收集后30分鐘內(nèi)，以1000×g離心15分鐘。立即測(cè)定或等分裝樣品，并將樣品儲(chǔ)存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血漿樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）

注：檸檬酸鹽抗凝劑血漿未經(jīng)驗(yàn)證可用于本試驗(yàn)，使用時(shí)應(yīng)自行驗(yàn)證可行性。溶血的樣品不適合用于該測(cè)定。

組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機(jī)研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測(cè)。

細(xì)胞裂解液：貼壁細(xì)胞用預(yù)冷PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用預(yù)冷PBS清洗3次，每1×10⁶個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL的PBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當(dāng)減少PBS體積）并通過(guò)反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)。

其它樣本類型：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。

試劑準(zhǔn)備

使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

洗滌液/稀釋液配置：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱⾄晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）

標(biāo)準(zhǔn)品配置：試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先將198ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200uL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至7000pg/mL（例：35uL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+965uL的1×稀釋液，制備得到1000μL的7000pg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將7000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：7000pg/mL、3500pg/mL、1750pg/mL、875pg/mL、437.5pg/mL、218.75pg/mL、109.38pg/mL從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0pg/mL)。

酶標(biāo)抗體工作液配置:使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)抗體稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。

備注：如待測(cè)樣本中VWF濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測(cè)樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配置工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。（若實(shí)驗(yàn)在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實(shí)驗(yàn)為長(zhǎng)時(shí)間跨度實(shí)驗(yàn)，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性）

實(shí)驗(yàn)步驟

    所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測(cè)

1. 酶標(biāo)板準(zhǔn)備：確定試驗(yàn)所需要的孔數(shù)，取下未使用的酶標(biāo)條放回裝有干燥劑的鋁箔袋。

2. 樣本孵育：每孔分別加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品以及預(yù)處理過(guò)的待測(cè)樣品，蓋上封板膠紙?jiān)?/span>37℃下孵育45分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動(dòng)30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。

3. 二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膠紙?jiān)?/span>37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟2中的清洗步驟4次。

4. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膠紙?jiān)?/span>37℃下避光孵育10-20分鐘。（根據(jù)樣品和對(duì)照抗體的顏色，自行控制顯色時(shí)間）

5. 終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液，輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

實(shí)驗(yàn)步驟匯總

1.加標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，37℃反應(yīng)45分鐘，洗滌3次。

2.加酶標(biāo)抗體，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。

3.加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。

4.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。

結(jié)果的計(jì)算

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

示例數(shù)據(jù)：以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計(jì)算應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計(jì)算樣本結(jié)果。

精密度

操作內(nèi)精密度（測(cè)定中的精密度）在一塊平板上對(duì)兩個(gè)已知濃度的樣品進(jìn)行20次測(cè)試，以評(píng)估測(cè)定內(nèi)精密性。

操作間精度（測(cè)定間精度）在10個(gè)單獨(dú)的測(cè)定中測(cè)試兩個(gè)已知濃度的樣品，以評(píng)估測(cè)定間精度。至少有三名技術(shù)人員進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。

回收率

回收率在不同基質(zhì)的整個(gè)測(cè)定范圍內(nèi)選取在健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入3個(gè)不同濃度水平的人VWF，計(jì)算回收率。

靈敏度 

經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為54.69pg/mL 

線性關(guān)系

分別在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人VWF，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。

特異性

該試劑盒測(cè)定可識(shí)別天然和重組人VWF。

其他相關(guān)因子在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測(cè)定交叉反應(yīng)性。沒(méi)有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。