細(xì)胞內(nèi)pH（Intracellular pH，pHi）是酶活性和細(xì)胞功能的重要生理決定因素，所有蛋白質(zhì)都依賴于嚴(yán)格調(diào)節(jié)的pH值以維持其結(jié)構(gòu)和功能。質(zhì)子 - 去質(zhì)子化可以指示生物表面的電荷，并且是許多代謝反應(yīng)中的組成部分。此外，跨線粒體膜的質(zhì)子梯度用于產(chǎn)生細(xì)胞能量并支持其他線粒體過(guò)程。因此，細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種機(jī)制來(lái)保持pHi的窄范圍，以響應(yīng)pH值的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外波動(dòng)。 細(xì)胞內(nèi)pH值檢測(cè)試劑盒采用P06細(xì)胞內(nèi)pH值熒光探針檢測(cè)胞內(nèi)pH值的變化。BBcellProbeTM P06是pH敏感的熒光染料，其在堿性條件下熒光強(qiáng)更高，反之酸性條件下變低，從而BBcellProbeTM P06可被用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH變化，見(jiàn)圖一。 P06是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，BBcellProbeTM P06本身沒(méi)有熒光，穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成熒光物質(zhì)，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。產(chǎn)生的熒光物質(zhì)最大激發(fā)波長(zhǎng)為 488nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 640nm，其在不同的pH值條件下發(fā)射的熒光強(qiáng)度不同，從而可以反映細(xì)胞內(nèi)pH值得變化情況。 P06主要用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究，也可用于其他動(dòng)物組織、植物細(xì)胞、細(xì)菌和酵母等的細(xì)胞內(nèi)pH水平檢測(cè)。在有細(xì)胞內(nèi)pH變化的細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附、藥物抵抗、細(xì)胞趨化等過(guò)程中也可應(yīng)用。實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為488-530nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為 640nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH值的變化。 本試劑盒內(nèi)P06探針母液500-5000倍稀釋后使用，一般1000-2000倍稀釋使用即可，按每個(gè)樣500 μl計(jì)算，50μl母液至少可以做100-200個(gè)樣品。 本試劑盒主要用于細(xì)胞內(nèi)pH值變化的定性檢測(cè)。如果需要測(cè)定細(xì)胞內(nèi)pH值數(shù)值。 可以提供各種細(xì)胞檢測(cè)試劑盒。包括細(xì)胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞膜流動(dòng)性、膜通透性轉(zhuǎn)換孔、細(xì)胞耗氧率、細(xì)胞內(nèi)pH、細(xì)胞粘附、細(xì)胞自噬等數(shù)百種檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品。
2.探針A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短時(shí)間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
4P06探針容易受潮，受潮后穩(wěn)定性較差，注意干燥保存。
5.吸取 P06探針母液時(shí)要用干燥的新吸頭，不能使用含水的吸頭。
6.未使用完的P06探針母液請(qǐng)擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。
7.試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！
2.離心機(jī)
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸頭
3.一次性手套
2.pH探針為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
3.P06探針容易受潮，受潮后穩(wěn)定性較差，注意干燥保存。
4.吸取P06探針母液時(shí)要用干燥的新吸頭，不能使用含水的吸頭。
5.未使用完的 P06探針母液請(qǐng)擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。
6. P06探針工作液含水，配制后不可以長(zhǎng)期保存，須現(xiàn)配現(xiàn)用。
7.細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。
8.標(biāo)記的條件因細(xì)胞種類而異，根據(jù)不同樣本的實(shí)際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整，在每次實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)先根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求、細(xì)胞類型、細(xì)胞的膜通透性等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳條件。以下方法僅供參考。
9.熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
10.染色后立即進(jìn)行分析。
11.可以在染色溶液中加入等體積的20% Pluronic F127溶液，Pluronic F127 可以幫助P06更快進(jìn)入細(xì)胞，不建議在Pluronic F127中長(zhǎng)期保存 P06溶液。
12.本試劑盒主要用于細(xì)胞內(nèi)pH值變化的定性檢測(cè)。如果需要測(cè)定細(xì)胞內(nèi)pH值數(shù)值
1. 染色工作液的配制：
根據(jù)樣品數(shù)，用探針稀釋液將P06探針進(jìn)行10倍稀釋， 然后再用HBSS緩沖液稀釋 P06溶液20倍-200倍，配制成P06染色工作液。
2. 將 P06染色工作液加入已處理好的細(xì)胞，在37℃孵育30-60 分鐘。
3. 用PBS或HBSS洗滌細(xì)胞2-3次。用HBSS重懸細(xì)胞。
4. 然后用該細(xì)胞進(jìn)行熒光細(xì)胞內(nèi)pH變化情況檢測(cè)。
激發(fā)波長(zhǎng) 488-530nm，發(fā)射波長(zhǎng)640nm。
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