4.     目的細胞最佳分離時間

血液離體后 2 小時內。如達不到 2 小時內分血條件，請務必于 4 小時內進行分血步驟， 超過 4 小時很難順利進行分離。

5.    分離液的使用環境

a.  分離液需常溫（15℃-25℃) 避光保存，嚴禁冷藏冷凍保存；

b.  使用時嚴格遵守無菌操作規范（超凈工作臺或生物安全柜內），并在 18℃-22℃環境溫 度下進行操作，20℃條件下分離效果最佳。超出此溫度范圍，有可能使分離液密度發生 改變，造成分離效果不佳。

6.    參考值（目的細胞參考范圍）

本試劑盒可保證目的細胞的提取率大于 80% ，不是純度。如需獲得高純度目的細胞， 請配合免疫磁珠分選。本試劑盒可減少磁珠的使用量，減少成本。

【檢驗方法】

全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃（試劑需要復溫。夏季 20℃ , 冬季 23℃ 。）的條件下進行。

實驗方法：方法一如下（不需血漿留存備用）：

1. 取一支 15ml 無菌離心管，先加入 5ml 分離液 1 ，后緩慢加入 2ml 分離液 2 ，形成梯度 界面，再緩慢吸取 2-3ml 新鮮抗凝血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。或 取一支 50ml 無菌離心管，先加入 15ml 分離液 1 ，后緩慢加入 5ml 分離液 2 ，再緩慢吸 取 5- 15ml 新鮮抗凝血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。（分離液試劑總 量不得少于 4ml ，新鮮抗凝血不得少于 2ml 。總液體量不得超過 2/3）。

2. 以 500g 或 600g ，離心 30min（注：如改變血液樣本及分離液用量，需相應調整離心力 及離心時間。）

3. 離心后，離心管中由上至下分為六層。第一層為血漿層。第二層環狀乳白色為（人及各 種動物）樹突狀細胞層(第一層白環及上層 50%分離液 2）。第三層環狀乳白色為單個核 細胞層(下層50%分離液 2 及第二層白環)。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細 胞層。第六層為紅細胞層。

4. ①小心吸取血漿層轉移到新離心管 A 中備用（分離效果不理想，可進行后續處理方案）。 ②小心吸取離心管中的（人及各種動物）樹突狀細胞層轉移到新離心管 B 中。

③小心吸取離心管中的單個核細胞層轉移到新離心管 C 中。

5. 向含有（人及各種動物）樹突狀細胞層離心管 B 中，加入 5- 10ml 清洗液，混勻細胞。

6. 250g ，離心 10min 。棄去上清。

7. 用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細胞。

8. 250g ，離心 10min ，棄去上清。

9. 重復清洗兩次，棄去上清，用 0.5ml 清洗液或根據下一步實 驗要求加入相對應液體，重懸所得細胞。

實驗方法：方法二如下（需留取血漿備用）：

1.  首先取抗凝血，250g ，離心 10min ，抽取血漿留存備用。補加胎牛血清(添加量與留存血 漿量等同)  制成細胞懸液，根據細胞懸液液體體積，選擇適當離心管進行試驗。

2.  取一支 15ml 無菌離心管，先加入 5ml 分離液 1 ，后緩慢加入 2ml 分離液 2 ，形成梯度界 面，再緩慢吸取 2-3ml 細胞懸液血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。或取一 支 50ml 無菌離心管，先加入 15ml 分離液 1，后緩慢加入 5ml 分離液 2，再緩慢吸取 5- 15ml 細胞懸液血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。（分離液試劑總量不得少于 4ml ，細胞懸液不得少于 2ml 。總液體量不得超過 2/3）。

3.  以 500g 或 600g ，離心 30min 。（注：如改變血液樣本及分離液用量，需相應調整離心力 及離心時間。）

4.  離心后，離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層環狀乳白色為（人及 各種動物）樹突狀細胞層(第一層白環及上層 50%分離液 2）。第三層環狀乳白色為單個核 細胞層(下層 50%分離液 2 及第二層白環)。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細胞 層。第六層為紅細胞層。

5.  ①小心吸取稀釋液層轉移到新離心管 A 中備用（分離效果不理想，可進行后續處理方案）。 ②小心吸取離心管中的（人及各種動物）樹突狀細胞層轉移到新離心管 B 中。

③小心吸取離心管中的單個核細胞層轉移到新離心管 C 中。

6.  向含有（人及各種動物）樹突狀細胞層離心管 B 中，加入 10ml 清洗液（產品編號： 2010X1118），混勻細胞。

7.  250g ，離心 10min 。棄去上清。

8.  用吸管吸取 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

9.  250g ，離心 10min ，棄去上清。

10.  重復清洗兩次，棄去上清，用 0.5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）或根據下一步實 驗要求加入相對應液體，重懸所得細胞。

分離圖

【分離過程中可能出現的情況及處理方案】

情況一：樹突狀細胞層和單個核細胞層混在一起不能分開

1.     吸取全部白色環狀細胞層，清洗后用備用的血漿 1-2ml 重懸細胞。

2.     使用分離液 2 重新提取樹突狀細胞。

3.     取 15ml 離心管，加入 4ml 分離液 2 ，將用血漿重懸的 1-2ml 細胞緩慢加于分離液之液 面上，400g ，離心 20min。

4.     離心后，離心管可分為 4 層，第一層血漿層，第二層樹突狀細胞層，第三層分離液層， 第四層單個核細胞層。

5.     可重復檢驗方法中的目的細胞洗滌方法，獲得樹突狀細胞

【注意事項】

1.  全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃（夏季 20℃ , 冬季 22-25℃) 的條件下進  行。為獲得最佳的實驗結果，最好在取血 2h 內進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離 效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

2.  本實驗最好不使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心 管及未經堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會 變成毛面，影響細胞分離效果。

3.  分離液用量大于血液樣本時，分離效果更佳。

4.  吸取過多的目的細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。

5.  如實驗后細胞得率或活性過低，請聯系 技術支持以尋求幫助，具體聯系方式 詳見下方生產企業信息。

【儲存條件及有效期】

常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實驗樹突狀細胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細胞的數量及比例，用戶可適當進行參考。

【可能存在的問題及解決方法】

1.    由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

2.    離心力公

3.    本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地 區客戶可根據當地情況對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離 心時間，對離心轉速進行調整。

4.    本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產同類產品略有不同，可 能出現紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉速。

注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以 50- 100g 為基數，直至達到最佳分離效果， 離心力最小不得小于 400g ，最大不得大于 1200g 。離心時間以 20-30min 為準。