本產品是 II發光法3D細胞活力檢測試劑盒(簡稱CTL 3D II，不同包裝版本，兩者的檢測效果完全一致。本產品，即CTL 3D為即用型液體，其優點是無需配制即可以直接使用，但長期保存需要置于-80℃，如果在-20℃保存時間較長后檢測效果會逐漸下降。CTL 3D II，為CTL 3D的凍干粉版本，優點是在-20℃保存非常穩定，缺點是使用前需要使用提供的緩沖液充分溶解底物凍干粉后才能使用。

傳統的細胞培養大多以二維(Two-Dimensional, 2D)的形式進行，隨著研究的深入，科學家們發現2D培養的細胞在生長方式、生長形態、細胞結構、細胞分化和生物學功能等方面都與體內生理條件下的細胞存在明顯差異，進而可能造成實驗結果和體內的真實情況存在較大偏差 [1-3]。三維(Three-Dimensional, 3D)細胞培養技術能夠更好地模擬生物體內細胞生存的微環境，細胞也可以保持其正常的生物學功能，能更好模擬體內組織，也能更真實地反映細胞與細胞間、細胞與基質間的相互作用，細胞對外源性和內源性刺激的應答也更接近于在體內的情況，3D細胞培養從而成為更具好的體外細胞實驗模型，能夠獲得與體內實驗更加相近或一致的實驗結果[4-5]。

3D腫瘤細胞模型越來越多地被用于了解疾病機制和藥物研發。2D培養的腫瘤細胞，其單側細胞膜可以均勻地獲得營養和氧氣，而3D培養的腫瘤細胞團的內部細胞獲得營養和氧氣的機會更少，形成自然的營養和氧氣梯度，能更好地模擬體內微環境條件，因此3D培養的腫瘤球狀體(Spheroid)或腫瘤類器官(Organoid)等能更好地模擬體內腫瘤，更利于小分子藥物篩選或者腫瘤相關分子機制的研究，也更能準確地預測藥物治療的體內反應、療效或毒性。同時，2D腫瘤細胞模型體外擴增有一定局限性，在傳代后容易喪失原腫瘤的遺傳異質性，出現優勢克隆選擇性，從而降低臨床相關性。相比于2D細胞模型，3D細胞球或者類器官很多情況下下能提供更可信的研究結果，簡化并加速藥物評價流程。自2009年小腸類器官首次建立至今，3D細胞和類器官研究已經擴展到很多組織系統，并成為生命科學最熱門的領域之一。

隨著3D細胞培養技術的日益成熟，3D細胞培養技術已經成為非常常用的研究工具，也越來越受歡迎，在基礎研究和藥物發現等中的應用越來越廣泛，而3D培養條件下的細胞活性檢測也成為一大難點。

ATP，作為最重要的能量分子，在細胞的各種生理、病理過程中起著重要作用。ATP是細胞新陳代謝的一個重要指標，也是具有代謝活性細胞的重要標志性分子，并和活細胞數目成良好的線性關系。因此，ATP含量能很好地反應活細胞的數目，即可以通過測定ATP含量來檢測細胞活力。

本試劑盒的檢測試劑經過優化具有強勁的裂解能力，可有效滲透至3D培養形成的球狀體內部，裂解所有細胞并釋放出ATP，最終通過測定ATP含量來檢測細胞活力。本試劑盒通過ATP檢測細胞活力的原理參見圖1。借助ATP依賴的螢光素酶催化的螢光素發光反應，ATP可以通過測定化學發光來進行定量。由于ATP含量能很好地反映活細胞的數目，而ATP含量和發光強度成正比，這樣就可以簡單地通過化學發光強度來計算出細胞活力或細胞數目。

圖1. 發光法3D細胞活力檢測試劑盒(C0061)檢測ATP的原理圖。

本產品操作簡單，讀數穩定，檢測速度快，完成檢測僅需約30分鐘。本產品比其它3D細胞活力測定方法更加簡單便捷，只需把試劑盒提供的發光法3D檢測試劑與細胞培養液等體積混合，振蕩5分鐘，再室溫孵育25分鐘后即可進行化學發光檢測。無需洗滌細胞，也無需更換或去除培養液。并且化學發光比較穩定，在反應開始后的10分鐘內下降不超過10%，30分鐘內的下降不超過30%，信號半衰期長達2-3小時。

本試劑盒的性能基本達到甚至在有些方面優于國外同類產品。本產品的用途與Promega公司的CellTiter-Glo^® 3D Cell Viability Assay (簡稱CellTiter-Glo^® 3D)基本相同。3D培養的細胞用本產品和國外同類產品(Competitor P)作用后細胞狀態基本一致(圖2)，但本產品的檢測靈敏度顯著優于國外同類產品(Competitor P) (圖3、圖4B)，發光強度比國外同類產品提高了約15%，化學發光的信號穩定性與國外同類產品(Competitor P)基本一致(圖4C)。本產品與國外同類產品(Competitor P)的檢測效果見圖2、圖3、圖4B和4C。

圖2. 發光法3D細胞活力檢測試劑盒(C0061)和國外同類產品(Competitor P)加入到3D培養的細胞前后的細胞狀態圖。10,000個HCT-116細胞接種于康寧^®球體微孔板(Corning^® 96-well Black/Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Surface Spheroid Microplate, Cat.4515/4520)，培養72小時后加入本產品和Competitor P。圖A和圖B為加入3D細胞活力檢測試劑前的3D細胞球；圖C和圖D為加入3D細胞活力檢測試劑作用5分鐘后的3D細胞球形態；圖E和圖F為3D細胞活力檢測試劑作用后，對細胞的染色效果圖。實際檢測效果會因細胞種類、細胞數目、細胞培養時間等的不同而存在差異，本圖僅供參考。

圖3. 發光法3D細胞活力檢測試劑盒和國外同類產品(Competitor P)對ATP標準品和3D細胞的檢測效果。圖A為本產品和Competitor P對3,000nM和10,000nM ATP標準品的檢測效果對比圖，圖B為5,000和10,000個HCT-116細胞在康寧^®球體微孔板培養72小時后用本產品和Competitor P的檢測效果對比圖。實際讀數會因細胞種類、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數據僅供參考。

本產品發光強度高。對于相同種類的細胞樣品，本產品的發光效果比國外同類產品(Competitor P)強約15-20% (圖3、圖4B)，實測效果會因細胞種類、細胞培養時間等的不同而有所不同。

圖4. 發光法3D細胞活力檢測試劑盒(C0061)和國外同類產品(Competitor P)對不同數量HCT-116細胞在康寧^®球體微孔板中的檢測效果。不同數量HCT-116細胞在康寧^®球體微孔板中培養72小后用本產品和Competitor P檢測細胞活性。圖A為不同數量HCT-116細胞培養24、48和72小時的細胞狀態圖，圖B為本產品和Competitor P對培養72小時后的3D細胞活性檢測效果對比圖，圖C為本產品和Competitor P對10,000個HCT-116細胞培養72小時后的化學發光穩定性的檢測效果對比圖。實際讀數會因細胞種類、細胞培養時間、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數據僅供參考。

本產品檢測靈敏度高，測定樣品的線性范圍寬。使用本產品檢測在康寧^®球體微孔板培養72小時的HCT-116細胞活性，細胞種板量僅為10個/孔時，發光強度即可達空白孔的5倍左右，檢測靈敏度特別高。在發光強度與細胞數量之間的線性關系上，對于3D培養的細胞，接觸抑制對細胞增殖產生的影響以及大型細胞球狀體中央區域代謝活性降低或者細胞壞死的影響，會導致細胞接種培養數天后進行活力測定的化學發光信號強度和細胞的接種數量之間的關系通常為曲線，但是發光信號的強度會隨著種板細胞數量的增加而升高(圖4B)。

本產品穩定性好。本試劑盒中的發光法3D檢測試劑穩定性好，反復凍融5次對檢測效果基本無影響，反復凍融10次檢測效果下降不超過10%。本產品4℃保存3天對檢測效果無顯著影響，4℃保存7天檢測效果下降不超過10%。室溫保存1天，仍可保留80%以上的檢測效果。37℃保存1天，可保持60%以上的檢測效果。

本產品使用靈活便捷。本產品不僅適合少量樣品的檢測，也非常適合大量樣品的高通量篩選(High-throughput screening)檢測，可用于各種培養方法培養出的3D細胞球，包括細胞懸滴培養板、超低吸附細胞培養板、Matrix-Gel™基質膠或Matrigel包被的平板、瓊脂糖包被的平板等。

對于96孔板，推薦使用100μl細胞培養液和100μl的檢測試劑，總體積為200μl，此時本產品每10ml可以進行100次檢測。對于384孔板，推薦使用25μl細胞培養液和25μl的檢測試劑，總體積為50μl，此時本產品每10ml可以進行400次檢測。也可以用其它體積的試劑進行檢測，但細胞培養液和檢測試劑體積的比例須為1:1。

保存條件：

-20℃避光保存，至少一年有效。 -80℃避光保存，可以保存更長時間。

注意事項：

本產品在-20℃保存其檢測效果會逐漸下降，保存一年后其發光效果會降低約40%。因此，如果希望本產品的發光效果更加穩定，推薦在-80℃避光保存。如果訂購后可能放置較長時間后再使用，推薦訂購在-20℃保存非常穩定

螢光素酶的活性對溫度比較敏感，因此反應前細胞和檢測試劑均需平衡至室溫后再進行測定�？蓪�檢測試劑在不超過25℃的室溫或20-25℃的水浴中融解并混勻后使用。溫度的高低會影響化學發光的信號強度和信號穩定性。

本試劑盒的檢測試劑中含有螢光素酶，反復凍融會導致其逐漸失活。盡管經測試本試劑反復凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，為取得良好的使用效果，第一次解凍后可適當分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染。反復凍融過程中，可能會導致檢測試劑中出現少量沉淀，此時宜平衡至室溫，并盡量溶解。如仍有殘留的不溶物，可以離心去除后使用，經測試不會影響后續的檢測效果。

待測藥物的溶劑含量較高時可能會干擾螢光素酶反應，從而影響化學發光信號。可以通過設置含有溶劑的細胞培養液對照孔排除溶劑的干擾。經測試，最終反應體系中DMSO含量在2%以內不會對反應產生影響。

檢測時需使用白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相鄰孔之間會產生相互干擾。也可使用專為3D培養的超低吸附培養皿或多孔板培養好3D細胞后，轉移至普通的白色或黑色多孔板中進行檢測。提供各種超低吸附培養皿或多孔板及普通白色或黑色多孔板，詳見相關產品。

使用說明中提供了檢測ATP標準品的方法，實際檢測細胞活力時通常并不需要檢測ATP標準品。

本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。