彩虹預(yù)染超低分子量蛋白質(zhì)Marker III（1.5-45 kD）
Rainbow Prestained Ultra Low Molecular Weight Protein Marker III（1.5-45 kD）
● 儲(chǔ)存、運(yùn)輸及效期：
-20℃保存，濕冰運(yùn)輸，有效期1年。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
彩虹預(yù)染超低分子量蛋白質(zhì)Marker III可以直接觀察蛋白電泳及清晰判斷Western Blotting的轉(zhuǎn)膜效果。本產(chǎn)品由7種多肽和蛋白質(zhì)組成，分子量大小為 1.5 kD，4 kD（紅色），8 kD， 15 kD（綠色），20 kD， 30 kD，45 kD (注：蛋白大小已在18%Tricine-SDS-PAGE中用非預(yù)染蛋白Marker標(biāo)定過(guò)。)
● 使用說(shuō)明：
第一次收到該產(chǎn)品，常溫融化后，徹底混勻，離心快甩將溶液完全收集到管底。
一. 制膠：
說(shuō)明：可以根據(jù)以下步驟自己制備凝膠。也可以選擇購(gòu)買我司Tris-Tricine-PAGE凝膠制備及電泳試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.1 配制分離膠
1.1.1 按照表1將組份加入到小燒杯中混合。
1.1.2加入10%APS和TEMED，立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。
1.1.3 在玻璃板中迅速灌入適量分離膠溶液，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長(zhǎng)0.5 cm即可（注：此溶液為過(guò)量，請(qǐng)勿全部注入）。然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。
1.1.4 靜置15-30分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。可以根據(jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。分離膠25℃條件下，約20分鐘可以聚合。
表1 （一塊1 mm mini膠用量）
|
| 分離膠 | 濃縮膠 |
|
| 18％T, 5%C /5 ml | 5％T, 3.3%C/2 ml |
| 40% PAA（19:1） | 2.25 ml | / |
| 40% PAA (29:1) | / | 0.25 ml |
| 4×凝膠緩沖液 | 1.25 ml | 0.5 ml |
| 乙二醇（電泳級(jí)） | 1.5 ml | / |
| ddH2O | / | 1.25ml |
| 10％APS | 50 μl | 20 μl |
| TEMED | 5 μl | 2 μl |
1.2 配制濃縮膠
1.2.1 去除覆蓋在分離膠上的乙醇層，用濾紙將殘留乙醇吸去。
1.2.2 按照表1將各組份加入到小燒杯中混合。
1.2.3 加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED，立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。
1.2.4 將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
1.2.5 靜置30-60分鐘裝待凝膠聚合
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。可以根據(jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。濃縮膠25℃條件下，約40分鐘可以聚合。
二. 電泳：
2.1 取Marker樣品，充分混勻后備用。不要加熱處理。
2.2 電泳前，將10×陽(yáng)極緩沖液和10×陰極緩沖液用蒸餾水稀釋成1×緩沖液備用。將電泳槽的外槽加入1×陽(yáng)極緩沖液，內(nèi)槽加入1×陰極緩沖液，輕柔拔出梳子，將Marker或蛋白樣品（已經(jīng)過(guò)2×Tricine上樣緩沖液[Cat No：TP050]處理）加入點(diǎn)樣孔，參考下表進(jìn)行電泳，至每條帶都清晰可見(jiàn)時(shí)停止電泳。整個(gè)電泳過(guò)程大約需要2-3個(gè)小時(shí)。
表2 多肽電泳條件
| 恒電壓 | 150V |
| 起始電流 | 60-75mA/板膠 |
| 結(jié)束電流 | 15-25mA/板膠 |
| 電泳時(shí)間 | 2-3小時(shí) |
三. 染色
根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟，用配方6和7（表3：參考隨貨說(shuō)明書）進(jìn)行染色和觀察。如果使用配方6進(jìn)行染色時(shí)效果不好或考慮其毒性，請(qǐng)選擇本公司的FastBlue蛋白染色液，該產(chǎn)品除具有染色快，無(wú)毒，靈敏性高等特點(diǎn)外，還能對(duì)小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。
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