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AGL1 Chemically Competent Cell

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 AGL1 Chemically Competent Cell為C58, RecA型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif和羧芐青霉素抗性基因carb,為了便于轉化操作,此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質粒 pTiBo542DT-DNA,此質粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件, pTiBo542DT-DNA質粒自身的T-DNA轉移功

基因型

C58 RecA (rifR/carbR) Ti pTiBo542DT-DNA Succinamopine

AGL1 Chemically Competent Cell產品說明

AGL1菌株為C58, RecA型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif和羧芐青霉素抗性基因carb,為了便于轉化操作,此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質粒 pTiBo542DT-DNA,此質粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件, pTiBo542DT-DNA質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞,但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。AGL1菌株適用于水稻、擬南芥、楊樹等植物的轉基因操作。本公司生產的AGL1化學轉化感受態細胞經特殊工藝制作,pCAMBIA2301質粒檢測轉化效率>10cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取-80℃保存的農桿菌感受態于室溫或手心片刻待其部分融化,處于冰水混合狀態時插入冰中。

2.每100 μl感受態加入0.01-1 μg質粒DNA(轉化效率較高,次使用前做預實驗確定所加質粒的量),用手管底混勻,依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。
3. 加入700 μl無抗生素的LB或YEB液體培養基,于28℃振蕩培養2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養箱培養2-3天

(當平板只含有50 μg/ml kan 時,28℃培養48 h即可;平板中同時加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 時,需28℃培養60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90 h)。

 

注意事項

1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10 ;質粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉化效率急劇下降;質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

 

2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質粒可相應減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時,由于營養不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應減少質粒用量。

4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農桿菌生長,會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。

 

5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌;根據所用菌株抗性加入Ti質粒篩選抗生素可防止Ti質粒丟失,但Ti質粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作,所以一般培養農桿菌時不考慮這些抗生素,Ti質粒丟失的概率極低 (可以忽略)。

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