| 產品編號 | 產品名稱 | 產品包裝 | |
| T100035-0.1ml | Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針 | 10mM×0.1ml | |
| T100035-1mg | Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針 | 1mg | |
| T100035-5mg | Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針 | 5mg | |
| T100035-25mg | Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針 | 25mg |
衰老細胞近紅外熒光探針(Senescence-Tracker™ Near-infrared, Senescence-Tracker™ NIR)，是一種新型的可用于體內或體外高亮度、高穩定性、高特異性、高生物安全性地檢測衰老細胞(Senescent cells, SnCs)的近紅外熒光探針。Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針能夠被衰老細胞特異性表達的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)特異識別并快速酶解，產生強烈的近紅外熒光信號。
本探針中國授權專利號為ZL202211569064.4，相關研究成果發表在國際衰老研究領域著名期刊Aging Cell (2023. 22(8):e13896)。
絕大多數正常細胞被認為僅具備有限的分裂能力，在停止分裂后就會逐漸進入衰老(Senescence)狀態。此時細胞仍然是存活的，但細胞的基因和蛋白的表達譜發生了巨大改變。衰老細胞不能再發生有絲分裂，并且衰老細胞的細胞周期分布也比較特殊，不同于某些損傷誘導的細胞休眠(Dormancy)，也不同于細胞生長接觸抑制產生的細胞靜默(Quiescence)。細胞衰老被認為是生物體抑制腫瘤的一種方式，但累積的衰老細胞同時也是生物體老化(Aging)的直接原因[2,3]。追蹤衰老細胞通常依賴于檢測衰老細胞的標記物和表型特征，如細胞周期抑制蛋白p16和p21、衰老相關分泌表型(Senescent associated secretory phenotype, SASP)和衰老相關的β-gal (Senescence-associated β-gal, SA-β-gal) [4-6]。其中，SA-β-gal是最為廣泛接受和使用的細胞衰老生物標志物。
Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針(Senescence-Tracker™ NIR)，又稱XZ1208，CAS號為3026598-16-0，分子式為C34H29N3O9，分子量為623.62，主要由3部分結構組成：DCM (Dicyanomethylene-4H-pyran)-衍生的NIR熒光團、β-Gal殘基和自裂解連接子(Self-immolative linker)。Senescence-Tracker™ NIR進入衰老細胞后，糖苷鍵被細胞內β-gal快速切割斷裂，隨后Senescence-Tracker™ NIR 的自裂解部分轉化為亞甲基苯醌(Quinone methides, QMs)，并最終激活NIR熒光團，產生強烈的熒光信號，最大激發波長為490 nm，最大發射波長為760nm，可根據儀器的差異適當優化波長(可參照圖1優化)。
本探針特異性強、靈敏度高。本探針僅染色衰老細胞，不會染色衰老前的細胞(Presenescent cells)、靜止期細胞(Quiescent cells)和大部分永生細胞(Immortal cells)；本探針在非衰老細胞和年輕小鼠中幾乎檢測不到熒光，但在衰老細胞和老年小鼠中可以檢測到顯著的熒光信號
本探針可應用于活體成像，組織穿透能力強，具有更低的本底熒光。常規的β-Gal熒光成像探針激發和發射的波長主要位于可見光范圍，生物組織的吸收、散射以及自發熒光干擾導致背景信號高、組織穿透力差，限制了這些探針體內成像的應用。而本探針的發射波長位于近紅外(Near-infrared, NIR)窗口，具有很好的組織穿透力、較低的背景熒光和生物損傷。
本探針穩定性好、追蹤間長、工作濃度低。經測試，在多種方式誘導衰老的人胚胎肺成纖維細胞(Human embryonic lung fibroblasts, HELF)和衰老的人真皮成纖維細胞(Human dermal fibroblasts, HDF)中，本探針染色細胞后約2小時，就可以迅速被切割并產生明顯的熒光，熒光信號約24小時后達到峰值，48小時仍能基本保持穩定；10μM的本探針處理HELF和HDF細胞48小時后換液，6天后細胞內仍可檢測到熒光信號；低至0.5μM的本探針即可有效標記衰老細胞；在小鼠模型中，尾靜脈注射低至5μM的本探針100μl，即可實現活體內實時檢測衰老程度，探針在1-2小時內能被完全激活，并顯示出非常強的熒光信號，標記效應可持續至少6天[1]。
本探針生物安全性高。經測試本探針在體外和體內模型，特別是多種衰老和衰老相關疾病模型(衰老、衰老相關纖維化、創面愈合)中無明顯毒性，可長期且安全地追蹤衰老細胞。用高達50μM的本探針孵育HELF和HDF細胞3天，細胞活力未見影響；給小鼠注射高劑量(10μM)的本探針，并在第7天檢測了血細胞組成、血漿生化指標和組織形態。結果顯示，經本探針處理的小鼠各項指標與對照組均無差異[1]。
本探針操作簡單，使用方便。常規的β-gal檢測法方法是基于β-gal催化X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)生成深藍色產物，如的細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、溶酶體β-半乳糖苷酶染色試劑盒。細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒方法注意事項繁多、實驗器具要求高、操作相對復雜，并無法進行活細胞或活體檢測。其它一些針對β-gal檢測方法雖然簡化了操作，使用更為便捷，但仍需要事先固定或者裂解細胞。而本探針可通過被動運輸穿過細胞膜，使用時，細胞水平只需進行簡單共孵育培養，小鼠模型只需進行尾靜脈注射即可，操作非常簡單，無需對細胞進行固定或裂解，可實時檢測活細胞的衰老或活體小鼠中的衰老細胞。
Senescence-Tracker™ NIR對衰老細胞和小鼠的染色、成像效果參考圖1。
圖1.衰老細胞近紅外熒光探針對體外和體內衰老細胞的染色效果圖。正常(Untreated)和經X光照射(X-ray treated)誘導衰老的HELF細胞(人胚胎肺成纖維細胞)的檢測效果見圖A (激發波長595nm，檢測波長650-701nm)；3個月齡年輕小鼠及20個月齡衰老小鼠的成像效果見圖B (激發波長436-500nm，檢測波長570-700nm)。可根據儀器的差異適當優化波長。實際檢測效果會因實驗條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數據僅供參考。
本探針提供10mM溶液裝和粉末裝。10mM溶液裝配制在DMSO中，每0.1ml可以配制約100ml Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)；每1mg粉末可以配制約160ml Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)。
保存條件：-20℃避光保存，至少兩年有效；粉末裝4℃避光保存，至少一年有效；室溫避光保存，至少一個月有效。
注意事項：
本探針為專利化合物，中國授權專利號為ZL202211569064.4，嚴禁侵權。如使用本探針發表論文等，請引用：Aging Cell. 2023. 22(8):e13896
本探針已經在衰老細胞(肺和皮膚來源的成纖維細胞)、自然衰老小鼠、輻照小鼠和皮膚損傷等模型中進行過驗證。在應用于其它衰老細胞相關的模型時，需要進行相應的優化以驗證探針效果。
須使用可以檢測近紅外熒光探針的激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡等熒光檢測設備用于衰老細胞的檢測；須使用可以檢測近紅外熒光探針的活體成像設備進行小鼠等活體的衰老細胞檢測。
初次使用時可適當分裝，避免反復凍融。
對于微量的液體，每次使用前先離心數秒鐘，使液體充分沉降到管底。
對于細胞染色，建議染色完成后立即進行觀測；如果條件限制，請避光4℃保存，并在24小時內進行檢測，放置時間過久可能會導致熒光部分猝滅。
熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.Senescence-Tracker™ NIR儲存液(10mM)的配制：
每1mg Senescence-Tracker™ NIR粉末加入160μl的無水DMSO (ST038)，充分溶解后，得到濃度為10mM的Senescence-Tracker™ NIR儲存液。適當分裝后避光保存于-20ºC或更低溫度。
注：本探針10mM溶液裝無須配制，可直接用于Senescence-Tracker™ NIR染色工作液的配制。
2.Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)或注射液(100μM)的配制：
a.染色工作液(10μM)的配制(用于細胞染色)：
(a)根據樣品數量及每個樣品所需的Senescence-Tracker™ NIR染色工作液的體積，取一定量Senescence-Tracker™ NIR儲存液(10mM)按照1:1000的比例加入到細胞培養液(含10% FBS)中，使最終濃度為10μM。例如取1µl Senescence-Tracker™ NIR儲存液(10mM)加入到1ml細胞培養液(含10% FBS)中，混勻后即為1ml 10μM的Senescence-Tracker™ NIR染色工作液。
(b)Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)須現配現用。
注：染色工作液中Senescence-Tracker™ NIR的濃度可以根據實際情況進行適當調整。為降低非特異性熒光染色，在染色效果可以接受的范圍內，建議盡量使用較低濃度的Senescence-Tracker™ NIR。
b.注射液(100μM)的配制(用于小鼠等注射)：
(a)按照1:2:97的比例混合Senescence-Tracker™ NIR儲存液(步驟1配制)、2% Tween-80和生理鹽水(ST341)，例如取10μl Senescence-Tracker™ NIR儲存液和20μl 2% Tween-80加入970μl生理鹽水中，混勻即得1ml 100μM的Senescence-Tracker™ NIR注射液。
(b)Senescence-Tracker™ NIR注射液(100μM)須現配現用。
3.對于懸浮細胞：
a.細胞按照實驗設計進行一定處理后，計數。取適當細胞600×g室溫離心5分鐘，棄上清，加入適當體積的Senescence-Tracker™ NIR染色工作液重懸細胞，使細胞密度為100萬-2000萬/ml。
b.細胞培養箱中37ºC孵育24小時，不同的細胞最佳孵育時間不同。以24小時作為初始孵育時間，根據實際檢測效果對孵育時間進行適當優化以得到更佳的檢測效果。
c.37ºC孵育結束后，600×g 4ºC離心3-4分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。
d.加入1ml PBS洗滌細胞，600×g 4ºC離心3-4分鐘，沉淀細胞，棄上清。重復洗滌2次。
e.再用適量PBS重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光酶標儀檢測或流式細胞儀分析。
注：如果需要在載玻片或蓋玻片上固定懸浮細胞，可選用Poly-D-lysine/多聚賴氨酸(ST508)處理載玻片或蓋玻片。
4.對于貼壁細胞：
本步驟以6孔板為例。其它孔板檢測試劑的用量參考6孔板的用量進行適當調整。
a.吸除培養液，PBS洗滌1次。
b.每孔加入1ml Senescence-Tracker™ NIR染色工作液。細胞培養箱中37ºC孵育24小時，不同的細胞最佳孵育時間不同。以24小時作為初始孵育時間，根據實際檢測效果對孵育時間進行適當優化以得到更佳的效果。
c.37ºC孵育結束后，吸除上清，用PBS洗滌3次。
d.每孔加入1ml PBS，熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。HELF細胞的檢測效果見圖1A。
注1：如果希望采用流式細胞儀檢測，可以收集細胞，PBS重懸后進行檢測。
注2：如果細胞貼壁不太好，可沿著孔板壁緩慢加入溶液，然后輕輕混勻，以避免細胞被沖散。
5.對于小鼠：
a.每只小鼠尾靜脈注射100μl Senescence-Tracker™ NIR注射液(100μM)。按照小鼠約2ml血液來計算，Senescence-Tracker™ NIR在血液中的粗略終濃度約為5μM。
b.24小時后麻醉小鼠并進行活體成像 (In vivo imaging systems, IVIS)。3個月年輕小鼠及20個月衰老小鼠的成像效果見圖1B。
注：小鼠Senescence-Tracker™ NIR注射液的濃度通常可以在50-300μM范圍內適當調整；體內的示蹤時間可根據實驗需要大致在1-6天內進行適當調整。
參考文獻：
1.Hu L, Dong C, Wang Z, He S, Yang Y, et al. Aging Cell. 2023. 22(8):e13896.
2.Baker DJ, Childs BG, Durik M, Wijers ME, Sieben CJ, et al. Nature. 2016. 530(7589):184-9.
3.Baker DJ, Wijshake T, Tchkonia T, LeBrasseur NK, Childs BG, et al. Nature. 2011. 479(7372):232-6.
4.Huang W, Hickson LJ, Eirin A, Kirkland JL, Lerman LO. Nat Rev Nephrol. 2022. 18(10):611-627.
5.Birch J, Gil J. Genes Dev. 2020. 34(23-24):1565-1576.
6.Itahana K, Campisi J, Dimri GP. Methods Mol Biol. 2007. 371:21-31.
