培養(yǎng)條件:
培養(yǎng)條件 | 氣相:95%空氣+5%二氧化碳;溫度:37℃ | ||
傳代方法 | 維持細(xì)胞濃度在2~4×105~8×105/ml,勿超過1×106/ml; | 傳代情況 | 每2-3天換液一次 |
備注 | 該細(xì)胞從一名1歲的患有急性單核細(xì)胞性白血病的男孩的外周血中分離建立。該細(xì)胞可以吞噬乳膠顆粒和激活的紅細(xì)胞,細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)均沒有免疫球蛋白,表達(dá)C3R和FcR;可受佛波酯TPA誘導(dǎo)向單核系方向分化;可作為轉(zhuǎn)染宿主 建議同時購買UHP-1/GFP完全培養(yǎng)基,同時購買非常優(yōu)惠 |
細(xì)胞收到后處理
培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個細(xì)胞瓶,消毒后放到超凈臺內(nèi)嚴(yán)格無菌操作,將細(xì)胞瓶放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理。顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況,并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存(最好40x,100x,200x各一張),前三天照片是重要售后依據(jù),不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好。(換液后將瓶蓋擰松)
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
a、細(xì)胞傳代:如果未超過80%匯合度時,將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5ml完全培養(yǎng)基,放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng);如果細(xì)胞密度超80%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
貼壁細(xì)胞傳代步驟如下:
1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞,使之完全脫落后吸出,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸。
4. 將細(xì)胞懸液按1:2的比例進(jìn)行分瓶傳代(兩個T25瓶),補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
懸浮細(xì)胞傳代步驟日下:
1、半換液法
半換液處理,豎著培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱靜置1小時左右,輕輕吸掉3ml左右培養(yǎng)基,然后補(bǔ)給3ml的完全培養(yǎng)基,如果培養(yǎng)基變色慢,可直接加500ul左右FBS,傳代的時候可以直接補(bǔ)給5ml培養(yǎng)基 分兩個培養(yǎng)瓶培養(yǎng),一般這樣傳代3次左右可以離心傳代一次,去掉死細(xì)胞。
2、離心換液法
如需分瓶可以將細(xì)胞懸液收集到離心管中1000rpm,離心5min,棄去上清,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力,后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
b、細(xì)胞凍存:
1、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞一次;
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min;
3、 棄上清,沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液(貨號:C7001),混勻后加入凍存管中。
4、 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
C、細(xì)胞復(fù)蘇:
1、從液氮中取出細(xì)胞凍存管(注意佩戴防護(hù)面具),快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁;
2、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min;
3、棄上清,沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種至T25培養(yǎng)瓶,放于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
4、第二天,換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
注意事項:有些細(xì)胞貼壁不牢,在運輸過程中容易發(fā)生細(xì)胞脫落,這是正常現(xiàn)象。如脫離較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5min,收集上清作過渡培養(yǎng)(后期對比培養(yǎng)),沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。再離心,棄上清,加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代(兩個T25),補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。