注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

規格:100T/48S

產品內容：

提取液：液體 50mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 0.6mL×1 支，-20℃保存； 試劑三：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×2 支，4℃保存，臨用前加入 1mL 雙蒸水，用不完的試劑仍 4℃保存；

試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存，臨用前加入 500µL 雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存； 試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 1.5mL 雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

產品說明：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，是三羧酸循環第一個限速酶，是三羧酸循環主要調控位點之一。

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產生檸檬酰輔酶 A，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使無色的DTNB 轉變成黃色的 TNB，在 412nm 處有特征吸光值。

試驗中所需的儀器和試劑：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本前處理

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 提取液和 10µL 試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

將勻漿液 600g，4℃離心 5min。

將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 CS。

在沉淀中加入 200µL 試劑一和 2µL 試劑二，反復吹打充分混勻，用于 CS 測定。檸檬酸合酶酶活即沉淀和上清液中的酶活之和。

二、測定步驟：

1、分光光度計/酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 412nm，蒸餾水調零。

2、試劑三置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動物）水浴中預熱 10min 左右（保證無沉淀）。

3、操作表：

在微量玻璃比色皿/96 孔板中分別加入

加試劑六的同時開始計時，記錄 412nm 波長下 10 秒時的初始吸光度 A1，之后迅速將比色皿連同反應液一起放入 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴中準確反應 2 分鐘（96 孔板放入恒溫箱中）；迅速取出比色皿并擦干，412 nm 下記錄 2 分 10 秒時的吸光度 A2，上清液、沉淀的測定管、對照管均需測量(每個樣本需測 4 管)。

計算上清液的測定管∆A1=A2-A1，上清液對照管的∆A1’=A2-A1，沉淀的測定管∆A2=A2-A1， 沉淀的對照管∆A2’=A2-A1，計算∆A 上清=∆A1-∆A1’，計算∆A 沉淀=∆A2-∆A2’。

三、CS 活性計算：

1、按微量玻璃比色皿計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃或 25℃下每 mg 組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS 上清（U/mg prot）=∆A 上清÷（ε×d）×V 反總÷（Cpr 上清×V 樣本）÷T

=1050×∆A 上清÷Cpr 上清

CS 沉淀（U/mg prot）=∆A 沉淀÷（ε×d）×V 反總÷（Cpr 沉淀×V 樣本）÷T

=1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀

CS（U/mg prot）=CS 上清+CS 沉淀=1050×∆A 上清÷Cpr 上清+1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：37℃或 25℃下每 g 組織在反應體系中每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS 上清（U/g 鮮重）=∆A 上清÷（ε×d）×V 反總÷（W×V 樣本÷V 提取）÷T =1061×∆A 上清÷W CS 沉淀（U/g 鮮重）=∆A 沉淀÷（ε×d）×V 反總÷（W×V 樣本÷V 沉淀）÷T =212×∆A 沉淀÷W CS（U/g 鮮重）=CS 上清+CS 沉淀=1061×∆A 上清÷W+212×∆A 上清÷W。

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：37℃或 25℃下每 1 萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS 上清（U/104 cell）=∆A 上清÷（ε×d）×V 反總÷（500×V 樣本÷V 提取）÷T=2.1×∆A 上清CS 沉淀（U/104 cell）=∆A 沉淀÷（ε×d）×V 反總÷（500×V 樣本÷V 沉淀）÷T =0.42×∆A 沉淀CS（U/104 cell）=CS 上清+CS 沉淀=2.1×∆A 上清+0.42×∆A 沉淀。

ε：TNB 的消光系數，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；V 反總：反應體系總體積，0.2 mL；d：比色皿光徑，1cm；V 樣本：加入的樣本體積，0.007mL；V 提取：提取液體積，1.01mL；V 沉淀：溶解沉淀的總體積，0.202mL；T：反應時間，2min；Cpr 上清：上清液的蛋白濃度，mg/mL；Cpr 沉淀：

 沉淀溶解后的蛋白濃度, mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細胞數量/細菌，500 萬。

3、按 96 孔板計算：將上述公式中的 d=1cm 改為 d=0.6cm（96 孔板光徑）進行計算即可。

注意事項：

1、測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。

2、比色皿中反應液的溫度必須保持 37℃或 25℃，取小燒杯一只裝入一定量的 37℃或 25℃蒸餾水， 將此燒杯放入 37℃或 25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。

3、最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。

4、用 96 孔板測定時，根據測定管數量配制測定管工作液（試劑三、四、五、六）和對照管工作液

（試劑三、四），因通過單位時間內吸光值變化計算酶活，不推薦同時測多個樣本。