正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不僅可以防止過(guò)多的銨離子對(duì)生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲(chǔ)存和運(yùn)輸形式。
測(cè)定原理
GS在ATP和Mg2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ─谷氨酰基異羥肟酸，在酸性條件下形成的絡(luò)合物在540nm處有最大吸收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。
所需的儀器和用品
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液：30mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：12mL×1瓶，-20℃保存，臨用前37℃預(yù)熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。
試劑二：12mL×1瓶，-20℃保存，臨用前37℃預(yù)熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。
試劑三：粉劑×2瓶，-20℃保存。用時(shí)每瓶加入5mL蒸餾水充分溶解待用。
試劑四：15mL×1瓶，4℃保存。
樣本測(cè)定的準(zhǔn)備
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 在EP管中加入下列試劑：
| 試劑名稱(chēng)（μL） | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
| 試劑一 | 400 |
|
| 試劑二 |
| 400 |
| 試劑三 | 175 | 175 |
| 樣本 | 175 | 175 |
混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴30min
| 試劑四 | 250 | 250 |
混勻，25℃室溫靜置10min后，5000g，25℃離心10min，取上清液測(cè)定540nm處的吸光值A。△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
GS活力單位的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.8348x + 0.0008，R2 = 0.9999
1、血清（漿）GS活性
單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。
計(jì)算公式：
GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷V樣÷T
=10.268×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞GS活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=10.268×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GS（μmol/h/g 鮮重）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T
=10.268×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨酰基異羥肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GS（μmol/h/104 cell）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.021×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.75mL； V樣：加入樣本體積，0.175mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
