注 意 : 正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
賴氨酸是人體必需氨基酸之一,能促進人體發育、增強免疫功能,并有提高中樞神經組織功能的作用。賴氨酸為堿性必需氨基酸。由于谷物食品中的賴氨酸含量甚低,且在加工過程中易被破壞而缺乏,故稱為第一限制性氨基酸。
測定原理:
蛋白質中的賴氨酸具有一個游離的ε-NH2,它與茚三酮試劑反應生成藍紫色物質,其顏色的深淺在一定范圍內與賴氨酸的含量成線性關系。亮氨酸與賴氨酸的碳原子數目相同,而且僅有—個游離氨基(ε-NH2),所以通常用亮氨酸配制標準液。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水、水浴鍋。
試劑的組成和配制:
提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入12.5mL試劑三充分溶解混勻;
試劑二:液體12.5mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:液體15mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:60%乙醇,自備。
賴氨酸提取:
樣本烘干粉碎,稱取約0.01g樣本,加入1mL提取液,充分勻漿。80℃水浴提取20min,冷卻后10000g離心10min,取上清待測。
測定步驟
1、 分光光度計預熱30min以上,調節波長至570nm,蒸餾水調零。
2、 工作液的配制:取10mL試劑一與10mL試劑二混合搖勻,取上清備用。用不完的試劑4℃保存。
3、 在有蓋EP管中加入下列試劑:
試劑名稱(μL) | 測定管 | 空白管 |
樣本 | 200 |
|
提取液 |
| 200 |
工作液 | 400 | 400 |
混勻,80℃水浴30min(蓋緊,以防止水分散失),冷卻至常溫。
試劑四 | 600 | 600 |
混勻,取1000μL至1mL玻璃比色皿中,于530nm波長處記錄吸光值A。△A=A測定管-A空白管。空白管只要做一管。
賴氨酸含量計算:
標準條件下測定回歸方程為y = 0.0062x - 0.0212;x為賴氨酸含量(µg/mL),y為吸光值。
1. 按照蛋白濃度計算
賴氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515
=185.73×(△A+0.0212) ÷Cpr
2.按照樣本質量計算
賴氨酸含量(µg/g干重)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515
=185.73×(△A+0.0212) ÷W
V1:加入反應體系中樣本體積,0.2mL;V2:加入提取液體積,1 mL; Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;1.1515,校正系數。