活性氧（ROS）包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。

一、測定意義：

 活性氧（Reactive oxygen species, ROS）包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，

參與細(xì)胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。本試劑盒采用的 DCFH-DA(2，

7-Dichlorofuorescin Diacetate)探針，是迄今最常用、最靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測探針。DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，會被細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)酯酶水解為 DCFH（Dichlorofluorescin）。而 DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有活性氧存在時，DCFH 被氧化為強綠色熒光物質(zhì) DCF（Dichlorofluorescein），其熒光在激發(fā)波長 488nm，發(fā)射波長 525nm 附近有最大波峰，其熒光強度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。一般細(xì)胞內(nèi)活性氧的升高是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志之一。該活性氧檢測系統(tǒng)本底低，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便。

 工作波長：最佳激發(fā)波長 488，最佳發(fā)射波長 525 (530±20 nm)。也可按照 FITC 熒光檢測條件檢測。

二、試劑組成及保存：

1、0.1mL 10mM DCFH-DA in DMSO，4-8℃保存。

2、1mL 活性氧陽性對照(Rousp,50mg/mL)，4-8℃保存。

三、試劑準(zhǔn)備：

 1、可將 DCFH-DA 稀釋于適宜的緩沖液，如無血清培養(yǎng)液或者 0.01M PBS。對于不同的處理步驟，DCFH-DA工作濃度可為 100nM～20µM，需進(jìn)行預(yù)實驗確定合適的濃度。總體稀釋倍數(shù)應(yīng)在 1：500～1：1000 以上以避免 DMSO 對細(xì)胞的影響，推薦初始濃度為 10µM。另外，對于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強，可以按照 1:2000~5000 稀釋 DCFH-DA，使裝載探針時 DCFH-DA 的濃度為 2~5μmol/L。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在 15~60 分鐘內(nèi)調(diào)整。

2、陽性對照可以按 1:1000 的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共 1mL，可以加入 1μL 的陽性對照刺激（通常刺激后 20~30 分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高）。對于不同細(xì)胞。活性氧對照的效果可能有較大的差異。如果在刺激后 30 分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度，反之如果活性氧升高過快則可以適當(dāng)降低它的濃度。活性氧陽性對照僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。如果用戶熟悉 ROS 熒光或?qū)嶒灈]有必要采用陽性對照管，如熒光顯微鏡檢測也可以不加該試劑。

四、組織樣本操作步驟：（可用激光共聚焦顯微鏡觀察，也可用于流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、熒光分光度計測定）

1、制備單細(xì)胞懸液：

方法 1、采用單細(xì)胞懸液制備儀制備單細(xì)胞懸液。

方法 2、酶消化法：

①、選取的組織立即放入預(yù)冷的組織培養(yǎng)液或 PBS 中，清洗血跡及其它污染物。去除組織塊中的塊死成分、纖維、脂肪及血管（專門制備相關(guān)細(xì)胞時除外）。

②、用眼科剪將組織塊剪成 1mm3 左右小塊，放在預(yù)冷的組織培養(yǎng)液或 PBS 中并進(jìn)行漂洗，洗去剪碎的細(xì)胞碎片。

③、加入適量酶消化液，37℃恒溫水浴消化 20～30min，期間進(jìn)行間斷振蕩或吹打細(xì)胞。

④、用組織培養(yǎng)液或 PBS 終止消化，用 300 目尼龍網(wǎng)過濾除去組織團塊，收集濾過的細(xì)胞，500g 離心 10min，去上清留沉淀，并用 PBS 洗 1～2 次。

方法 3、機械法（網(wǎng)搓法）：

①、前處理同酶消化法⑴、⑵步。

②、將 300 目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上，將剪碎的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷或刮刀輕搓組織塊，邊搓邊用 PBS 沖洗，直至將組織搓完。

③、收集細(xì)胞懸液，500g 離心 10min，去上清留沉淀，并用 PBS 洗 1～2 次。

2、加入熒光探針：

①、取不進(jìn)行任何處理的細(xì)胞用 0.01M PBS 重懸，設(shè)為陰性對照管。陽性對照管：用稀釋好的 DCFH-DA 重懸細(xì)胞沉淀，同時加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞。

②、樣本管：用稀釋好的 DCFH-DA 重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞密度一般要求 1×106-2×107/mL。

③、37℃孵育細(xì)胞 30min～幾小時，每隔 3-5 分鐘顛倒混勻一下，使探針與細(xì)胞充分接觸。通常為 20～60min即可，孵育時間長短與細(xì)胞類型、刺激條件以及 DCFH-DA 濃度有關(guān)。

④、收集孵育（探針標(biāo)記）后的單細(xì)胞懸液，1000g，離心 5～10 分鐘，去上清收集細(xì)胞沉淀，用 PBS 洗滌 1～

2 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 DCFH-DA。離心收集細(xì)胞沉淀用于熒光檢測；

3、熒光檢測：

①、將上述收集好的細(xì)胞沉淀用 PBS 重懸，并用于檢測；

②、波長設(shè)置：最佳激發(fā)波長 488nm，最佳發(fā)射波長 525nm。也可按 FITC 熒光檢測條件檢測。

③、結(jié)果以熒光度值表示。

五、細(xì)胞樣本操作步驟：（可用激光共聚焦顯微鏡觀察，也可用于流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、熒光分光度計測定）

1、直接將探針加入培養(yǎng)液中(該方法只適用于貼壁細(xì)胞)：

①、直接將 DCFH-DA 探針加入無血清培養(yǎng)基中：一般按照 1：1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋 DCFH-DA(終濃度為 10µM)。去除培養(yǎng)液后，加入適當(dāng)體積稀釋好的 DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對于 6 孔板的一個孔加入稀釋好的 DCFH-DA 不少于 1mL。

②、取一份不加探針，只加入培養(yǎng)基的細(xì)胞設(shè)為陰性對照管。陽性對照管：取一份已加入探針的細(xì)胞，同時加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞。

③、37℃孵育細(xì)胞 20min～幾小時（每隔 3~5 分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸），通常為 20min，孵育時間長短與細(xì)胞類型、刺激條件、DCFH-DA 濃度有關(guān)。一般陽性對照在刺激細(xì)胞 20~30 分鐘后，即可觀察到明顯的綠色熒光。

④、吸去培養(yǎng)液，利用無血清培養(yǎng)液或者 0.01MPBS 反復(fù)吹打，肉眼觀察瓶底由半透明(細(xì)胞單層連接成片)轉(zhuǎn)為透明，細(xì)胞層幾乎全部吹打到 PBS 中。

⑤、將細(xì)胞懸液全部收集到 1.5mL 離心管中。用無血清培養(yǎng)液或者 PBS 洗滌 2 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸凈上清后加入 PBS 重新懸浮細(xì)胞進(jìn)行測定。

⑥、波長設(shè)置：最佳激發(fā)波長 488nm，最佳發(fā)射波長 525nm。也可按照 FITC 熒光檢測條件檢測。

⑦、結(jié)果以熒光度值表示。

2、先收集細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液后測定(該方法適用于貼壁細(xì)胞及懸浮細(xì)胞)

①、細(xì)胞收集：

a、貼壁細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，利用無血清培養(yǎng)液或者 0.01MPBS 反復(fù)吹打，肉眼觀察孔板底部(瓶底)由半透明(細(xì)胞單層連接成片)轉(zhuǎn)為透明，細(xì)胞層幾乎全部吹打到 PBS 中。

b、將細(xì)胞懸液全部收集到 1.5mL 離心管中。用無血清培養(yǎng)液或者 0.01MPBS 洗滌 2 次，1000rpm/min，離心 5min，吸凈上清，留細(xì)胞沉淀用于測定。

c、懸浮細(xì)胞按照常規(guī)方法離心(2000rpm/min，離心 5min)，收集細(xì)胞沉淀，用無血清培養(yǎng)液或者 0.01M PBS 洗滌 2次，1000rpm/min，離心 5min，吸凈上清，留細(xì)胞沉淀用于測定。

②、細(xì)胞重懸：細(xì)胞密度一般要求 1×106-2×107/mL，一般有兩種方法：

a、先加入無血清培養(yǎng)液或者 PBS 重懸細(xì)胞，然后根據(jù)加入培養(yǎng)液或者 PBS 的體積，按照 10µM 的初始濃度(最好做預(yù)實驗確定自身樣本適合濃度)加入探針，(適用于預(yù)實驗及少量樣本的情況)

b、先按照 10µM 的濃度將探針用無血清培養(yǎng)液或者 PBS 先稀釋好，然后用稀釋好的探針重懸上述細(xì)胞沉淀，制備成細(xì)胞懸液，(適用于樣本較多的情況)

③、取一份不加探針，只加入培養(yǎng)基或 PBS 的細(xì)胞設(shè)為陰性對照管。陽性對照管：取一份已加入探針的細(xì)胞懸液，同時加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞。

④、37℃孵育細(xì)胞 20min～幾小時，通常為 20～60min 即可，孵育時間長短與細(xì)胞類型、刺激條件、DCFH-DA 濃度有關(guān)；每隔 3-5 分鐘顛倒混勻一下，使探針與細(xì)胞充分接觸。

⑤、收集孵育（探針標(biāo)記）后的單細(xì)胞懸液，1000rpm/min，離心 5min，吸凈上清，用 PBS 洗滌 1～2 次，離心收集細(xì)胞沉淀物用于熒光檢測。

⑥、將上述收集好的細(xì)胞沉淀用 PBS 重懸，并用于檢測。

⑦、波長設(shè)置：最佳激發(fā)波長 488nm，最佳發(fā)射波長 525nm。也可按照 FITC 熒光檢測條件檢測。

⑧、結(jié)果以熒光度值表示。

六、相關(guān)注意事項

1、懸浮熒光探針標(biāo)記后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景不干凈熒光值偏高。

2、重懸的細(xì)胞密度可根據(jù)細(xì)胞的熒光強弱進(jìn)行調(diào)整，如熒光較強可將細(xì)胞密度調(diào)小，如熒光較弱可將細(xì)胞密度調(diào)大，但所有樣本的細(xì)胞密度應(yīng)保持一致。

3、測定細(xì)胞樣本時，對于藥物作用時間在 2 小時以內(nèi)的細(xì)胞，一般建議先標(biāo)記探針，然后再用藥物刺激細(xì)胞，對于藥物作用時間需要在 6 小時以上的細(xì)胞，可以先用活性氧陽性對照及藥物刺激細(xì)胞，然后再標(biāo)記探針。

4、同時取部分單細(xì)胞懸液經(jīng)過超聲或勻漿破碎處理，用于蛋白的測定（蛋白定量試劑盒本所有售，推薦 A045-2考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量試劑盒、A045-3 BCA 法蛋白定量試劑盒），用于結(jié)果計算表示為熒光度值/毫克蛋白。

5、熒光一般是用熒光發(fā)射的強度，不過由于不同的儀器表示方法不一樣，有的用光能量，有的用光子計數(shù)，不同的儀器測定值之間沒有可比性，一般都用相對值表示。因此其單位是任意單位(Arbitrary Unit，AU)