1 原理及用途

甲砜霉素檢測試劑盒（酶聯免疫法）采用間接競爭ELISA方法檢測畜禽組織、蜂蜜、雞蛋樣本中的甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣本溶液，樣本中的甲砜霉素藥物和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗甲砜霉素藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含甲砜霉素藥物含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中甲砜霉素藥物的殘留量。

2 技術指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)

2.2 反應模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

組織、蜂蜜……………………………0.25ppb

雞蛋……………………………………1ppb

2.4 交叉反應率：

甲砜霉素………………………………100%

氟苯尼考………………………………36.4%

氯霉素…………………………………308%

 2.5 樣本回收率：

組織……………………………………85%±20%

蜂蜜……………………………………85%±25%

雞蛋……………………………………85%±25%

3 試劑盒組成

酶標板……………………………96孔

標準液：各1ml

0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

高標準液（紅蓋）：100ppb…………1ml

酶標記物（紅蓋） …………………5.5ml

抗體工作液（藍蓋） ………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

2×復溶液（黃蓋）…………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。

5.2 配液：

配液1：復溶液

將2×復溶液用去離子水2倍稀釋（1份2×復溶液加1份去離子水），用于樣本的復溶，復溶液在4℃環境可保存一個月。

配液2:工作洗滌液

將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

配液3：乙腈-水溶液

    V乙腈:V水=84:16

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織樣本處理方法 

1）稱取均質后的樣本3±0.05g于50ml離心管中，加入6ml乙酸乙酯振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體4ml在50-60℃下氮氣吹干；

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，震蕩均勻,再加入1ml復溶液，混合1分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

4）去除上層有機相，取下層水相50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：0.5    檢測下限：0.25ppb

5.3.2 蜂蜜樣本處理方法

1）取2±0.05g蜂蜜于離心管中，用4ml去離子水溶解，加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體2ml在50-60℃下氮氣吹干；

3）用0.5ml復溶液溶解干燥的殘渣，混勻；

4）取50μl進行分析。

樣本稀釋倍數：0.5    檢測下限：0.25ppb

5.3.3 蛋類樣本處理方法

1）取3±0.05g均質的蛋類樣本于50ml離心管中，加9ml乙腈-水溶液振蕩混合2分鐘，15℃4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體3ml于另一離心管中，加入3ml去離子水，再加4.5ml乙酸乙酯振蕩1分鐘，15℃4000轉/分離心10分鐘；

3）取全部上層液體在50-60℃下氮氣吹干；

4）用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，再加入2ml復溶液，混合30秒，室溫4000轉/分離心5分鐘；

4）去除上層有機相，取下層水相50μl進行分析。

樣本稀釋倍數：2    檢測下限：1ppb

6 甲砜霉素檢測試劑盒（酶聯免疫法）酶聯免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，最后一次拍干。（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。

6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。

7 結果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 甲砜霉素檢測試劑盒（酶聯免疫法）注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。