1 己烯雌酚類(lèi)檢測(cè)試劑盒原理及用途

己烯雌酚是甾類(lèi)同化激素，被大量用于促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)。但由于己烯雌酚存在明顯的致癌性，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已相繼禁止或嚴(yán)格禁止使用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件中規(guī)定，動(dòng)物源性食品中己烯雌酚的殘留限量為不得檢出。

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)組織樣本中的己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的己烯雌酚和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗己烯雌酚抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含己烯雌酚含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較即可得出樣本中己烯雌酚的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)  

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～30min～15min

2.3 檢測(cè)下限：

組織（蝦、魚(yú)）………………………0.2ppb

豬肉/肝、雞肉/肝……………………0.5ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

己烯雌酚………………………………100%

雙烯雌酚………………………………38.5%

己烷雌酚………………………………8.5%

乙炔雌二醇……………………………<0.1%

雌三醇…………………………………<0.1%

 2.5 樣本回收率：

組     織   ……………………… 85%±10%

3 己烯雌酚類(lèi)檢測(cè)試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)品：各1ml

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液：100ppb……………………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）……………………11ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）…………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說(shuō)明書(shū)…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：甲醇、乙腈、氫氧化鈉、氯仿（三氯甲烷）、丙酮、濃磷酸（含量85%）

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：6M H₃PO₄ 溶液

100ml 濃H₃PO₄（含量85%）加去離子水混勻，定容至150ml。

配液2：2M NaOH溶液

    8gNaOH加去離子水混勻溶解，定容至100ml。

配液3：40%甲醇

    V甲醇：V去離子水=2:3

配液4：乙腈-丙酮混合液

V乙腈：V丙酮=4:1

配液5：工作洗滌液

將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚(yú))樣本處理方法 

1）稱(chēng)取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6ml乙腈-丙酮混合液，振蕩2min，15℃4000r/min離心10min；

2）取3ml上清液，60℃氮?dú)?空氣吹干；

3）加入0.5ml氯仿（三氯甲烷），振蕩20s，加入2ml 2M NaOH，振蕩30s，4000r/min離心5min；

4）取上清液1ml，加入200µl 6M H₃PO₄，振蕩5s；

5）加入3ml乙腈萃取，振蕩2min，室溫4000r/min離心10min，取1.5ml上層有機(jī)相，60℃氮?dú)?空氣吹干；

6）不同樣本按如下方法復(fù)溶：

A）蝦魚(yú)：用1ml 40%甲醇溶液溶解干燥的殘留物，振蕩混勻30s。取50ul用于檢測(cè)。

    樣本稀釋倍數(shù)：4   檢測(cè)下限：0.2ppb

B）豬肉/肝、雞肉/肝：用2.5ml 40%甲醇溶液溶解干燥的殘留物，振蕩混勻30s。取50ul用于檢測(cè)。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測(cè)下限：0.5ppb

6 己烯雌酚類(lèi)檢測(cè)試劑盒酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開(kāi)蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過(guò)淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間）。

6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來(lái)電索取）

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線(xiàn)照射。

8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。