1 氟苯尼考檢測試劑盒原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產(chǎn)組織、畜禽組織、肝臟、蛋類、蜂蜜、牛奶及飼料等樣本中的氟苯尼考藥物（Florfenicol，FF），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣本溶液，樣本中的氟苯尼考藥物和酶標板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗氟苯尼考藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含氟苯尼考藥物含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中氟苯尼考藥物的殘留量。

2 技術(shù)指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.15ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

組織、肝臟、蜂蜜、牛奶……………0.075ppb

飼料、奶粉……………………………0.15ppb

蛋類……………………………………0.075ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

氟苯尼考………………………………100%

甲砜霉素………………………………＜2.5%

氯霉素…………………………………＜0.1%

2.5 樣本回收率：

組織、肝臟……………………………85%±20%

蜂蜜……………………………………85%±25%

牛奶、飼料……………………………75%±25%

蛋類、奶粉……………………………70%±25%

3 氟苯尼考檢測試劑盒組成

酶標板……………………………96孔

標準液：各1ml

0ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb、12.15ppb

高標準液（紅蓋）：100ppb…………1ml

酶標記物（紅蓋） …………………5.5ml

抗體工作液（藍蓋） ………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

2×濃縮復溶液（黃蓋）………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、亞硝基鐵氰化鈉、硫酸鋅

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.36M亞硝基鐵氰化鈉溶液（牛奶、奶粉樣本）

10.7g亞硝基鐵氰化鈉加去離子水混勻溶解，定容至100ml。

配液2：1.04M硫酸鋅溶液（牛奶、奶粉樣本）

    29.8g硫酸鋅加去離子水混勻溶解，定容至100ml。

配液3：乙腈-水溶液

    V乙腈:V水=84:16

配液4：復溶液

將2×濃縮復溶液用去離子水2倍稀釋（1份2×濃縮復溶液加1份去離子水），用于樣本的復溶，復溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液5:工作洗滌液

    將20×濃縮洗滌液20倍稀釋(1份20×濃縮洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織、肝臟樣本處理方法 

1）稱取均質(zhì)后的樣本3g±0.05g于50ml離心管中，加入6ml乙酸乙酯振蕩5min，室溫4000r/min離心10min；

2）取上層液體4ml于50-60℃下氮氣或空氣吹干；

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，振蕩均勻,再加入1ml復溶液(配液4)，混合1min，室溫4000r/min離心10min；

4）去除上層有機相，取下層水相50µl進行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測下限：0.075ppb

5.3.2 蜂蜜樣本處理方法

1）稱取2g±0.05g蜂蜜于離心管中，用4ml去離子水溶解，加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，室溫4000r/min離心10min；

2）取上層液體2ml于50-60℃下氮氣或空氣吹干；

3）用0.5ml復溶液(配液4)溶解干燥的殘渣，混勻；

4）取50µl進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測下限：0.075ppb

5.3.3 蛋類樣本處理方法

1）稱取2g±0.05g均質(zhì)樣本于離心管中，加入8ml乙酸乙酯振蕩2min，室溫4000r/min離心10min；

2）取上層液體4ml于50-60℃下氮氣或空氣吹干；

3）用2ml正己烷溶解干燥的殘渣,再加入0.5ml復溶液(配液4)，混勻，振蕩4min；室溫4000r/min離心5min；

4）去除上層有機相，取下層水相50µl進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測下限：0.075ppb

5.3.4 牛奶樣本處理方法

1）將牛奶樣本室溫4000r/min離心10min，去除上層脂肪，取5ml去脂肪奶樣于50ml離心管中，加250µl亞硝基鐵氰化鈉溶液（配液1）振蕩混勻30秒，加250µl硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，室溫4000r/min離心10min；

2）取上層液體2.2ml（相當于2ml鮮奶）于另一離心管中，加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，室溫4000r/min離心10min；

3）取上層液體2ml于50-60℃下氮氣或空氣吹干；

4）用0.5ml復溶液(配液4)溶解干燥的殘渣，混勻；

5）取50µl進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測下限：0.075ppb

5.3.5 奶粉樣本處理方法

1）稱取2g±0.05g奶粉于50ml離心管中，用10ml去離子水溶解，加入1ml 亞硝基鐵氰化鈉溶液（配液1）和1ml 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合，室溫4000r/min離心10min；

2）取上層液體3.6ml（相當于0.6g奶粉）于另一離心管中，加入6ml乙酸乙酯振蕩5min，室溫4000r/min離心10min；

3）取上層液體4ml于50-60℃下氮氣或空氣吹干；

4）用0.4ml復溶液(配液4)溶解干燥的殘渣，混勻；

5）取50µl進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.15ppb

5.3.6 飼料樣本處理方法

1）稱取2g±0.05g均質(zhì)的飼料于50ml離心管中，加入8ml乙酸乙酯振蕩5min，室溫4000r/min離心10min；

2）取上層液體4ml于50-60℃下氮氣或空氣吹干；

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，再加入1ml復溶液(配液4)，混合30秒，室溫4000r/min離心5min；

4）去除上層有機相，取下層水相50µl進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.15ppb

6 氟苯尼考檢測試劑盒試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30min。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350µl工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，最后一次拍干。（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15min（若藍色過淺，可適當延長反應(yīng)時間）。

6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10min內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。